HBV相关肝纤维化小鼠模型的建立及关键表型深度分析研究

目的 探索HBV感染所致肝纤维化小鼠模型形成条件及表型分析。方法 以18只CBA/CaJ小鼠为研究对象,随机分为对照组(n=4)和实验组(n=14),实验组按照每只2μg的剂量、通过高压水动力方法进行尾静脉注射cccDNA,对照组注射等体积PBS,转染68周后采样。通过qPCR方法检测肝中HBV DNA及HBV cccDNA,ELISA方法检测血清HBsAg、HBeAg,免疫组化检测肝组织中HBsAg、HBcAg,用一代测序法检测HBeAg⁺/HBsAg^-及HBeAg^-/HBsAg⁺组织DNA基因测序,生化分析ALT和AST,HE染色、天狼星染色及Masson染色分析肝组织病理。结果 实验组中,100%的小鼠HBV-DNA拷贝数高于1000 copies/mL;小鼠肝组织cccDNA拷贝数显著高于空白组(P<0.05);42.9%的小鼠血清HBsAg和HBeAg呈阳性;60%的小鼠肝HBsAg呈阳性和26.7%的小鼠肝HBcAg呈阳性;HBeAg^-/HBsAg^+...     

化学发光Southern blot法检测HBV体外复制及其应用于药物对HBV的抑制分析

目的：建立化学发光Southern blot检测细胞内HBV DNA的方法,同时检测3种不同靶点抗乙肝药物的体外作用。方法：用地高辛标记HBV探针,优化杂交条件,检测来自HepG2及HepG2.2.15 HBV DNA复制中间体;利用建立的化学发光Southern blot检测HBV DNA的方法检测经拉米夫定、Bay41-4109、α-Galcer以不同药物浓度处理的HepG2.2.15HBV DNA复制中间体的水平。结果：（1）标记的HBV探针的检测灵敏度为0.1pg,杂交系统的检测灵敏度为1pg,可检测到HepG2.2.15细胞内的HBV DNA特异性信号;（2）以该法检测胞内HBV DNA可见3种药物都有明显的抑制作用,其半数有效量（IC50）分别为1.53μmol/L、0.41μmol/L、0.01μmol/L。结论：胞质HBV DNA的水平能准确地反映不同靶点抗HBV药物的抗病毒效果,建议在观察药物特别是中药抗病毒研究中采用。     

KNK437抑制乙型肝炎病毒复制及转录

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝细胞内复制过程中,病毒反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物,启动反转录合成和核衣壳装配。封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时,需要热休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)参与。本研究探索Hsps抑制剂KNK437对HBV复制及转录的影响。主要运用了三种工作模型:HepG2.2.15细胞系、瞬时转染1.05×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和瞬时转染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系。采用CCK-8方法检测KNK437的细胞毒性,ELISA测定细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平;Western blotting检测细胞内衣壳亚单位(core)表达水平;qRT-PCR检测细胞内Hsps本身的转录水平。结果表明:20μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下调HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成,降低细胞内HBV RNA转录水平,最低可使DNA水平降至1.5%左右,RNA水平降至30%左右,从而表明KNK437抑制HBV复制和转录。在HepG2.2.15中的Western blotting显示,KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位(core)表达水平。KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三种热休克蛋白RNA的转录,从而验证了它的确是一种泛Hsps抑制剂。本研究结果显示KNK437具有潜在抗HBV应用前景。     

利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型

目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。     

NIRF对HBV复制的影响及其对组蛋白H3乙酰化水平的修饰

为研究NIRF(Np95/ICBP-90 like RING finger protein)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制以及与乙型肝炎病毒共价环状闭合DNA(HBV cccDNA)结合的组蛋白H3乙酰化的影响,采用脂质体转染将pGEM-HBV1.3+pFLAG、pGEM-HBV1.3+pFLAG-NIRF、pGEM-HBV1.3质粒分别转入HepG2细胞,Western blot检测NIRF蛋白的表达,用ELISA结合RT-PCR检测HBsAg、HBeAg以及HBV cccDNA的量并同时说明HBV在细胞内是完成完整复制表达的,采用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法检测与HBV cccDNA结合的组蛋白H3以及H3乙酰化水平的动态变化。结果显示,NIRF蛋白下调HBV标志物HBeAg、HBsAg的分泌以及HBV cccDNA的表达,表明其对HBV复制具有抑制作用;组蛋白H3及乙酰化的组蛋白H3都与HBV cccDNA的动态变化水平呈现相似的平行性,而NIRF蛋白也明显抑制组蛋白H3的表达水平和乙酰化水平。结论证实NIRF不仅能抑制HBV在肝癌细胞中的复制,而且能下调与HBV cccDNA结合的组蛋白H3和乙酰化组蛋白H3的表达。期待NIRF能为后续的HBV致病机理、HBV复制表观遗传学水平研究及有效抗病毒药物的研究与开发提供理论上的支持与帮助。     

恩替卡韦治疗对HBeAg阳性乙肝患者血清和肝组织中HBV cccDNA的影响

目的探讨口服恩替卡韦治疗HBe Ag阳性乙肝患者1年对血清和肝组织中HBV cccDNA含量的影响。方法选取90例HBe Ag阳性乙肝患者,所有患者连续48周口服恩替卡韦0.5 mg/d,治疗前后分别静脉取血分离血清。采用化学发光法检测HBV血清标志物、采用荧光实时定量PCR法检测HBV-DNA及HBV cccDNA含量,并对各指标进行统计学分析。选取治疗48周后血清HBV cccDNA阴性且符合肝穿的患者进行肝穿检查,检测肝组织中HBV cccDNA含量。结果 (1)治疗后,血清HBV-DNA、HBV cccDNA及谷丙转氨酶(ALT)水平均显著下降(P0.01)。(2)发生e抗原转换组的HBV DNA和HBV cccDNA水平下降均比未发生转换组更显著(P0.01)。(3)90例患者在治疗1年后有68例患者血清中HBV cccDNA转阴,而在这其中选取8例患者进行肝穿,只有1例患者的肝组织中HBV cccDNA转阴。结论尽管恩替卡韦可明显降低乙肝患者血清和肝组织的HBV cccDNA水平,然而恩替卡韦治疗1年尚不能彻底清除肝细胞中的HBV。     

半乳糖凝集素-3结合蛋白作为正向调节因子参与IFN-γ介导的抗HBV作用

摘要 目的：研究半乳糖凝集素-3结合蛋白（LGALS3BP）在IFN-?酌介导的抗HBV中的作用。方法：采用qRT-PCR及Western Blot分别检测HepG2细胞瞬转过表达质粒及干扰质粒后LGALS3BP转录水平和翻译水平的变化及检测IFN-γ对HepG2细胞内源性LGALS3BP转录水平和翻译水平的影响；采用CCK-8评价LGALS3BP表达量的变化对HepG2细胞增殖的影响及确定IFN-γ处理HepG2和HepG2.215的最适浓度；采用ELISA检测当LGALSEBP表达量发生变化时，IFN-γ刺激后对细胞外分泌的HBsAg和HBeAg的影响；采用q-PCR和RT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平。结果：40 ng/mL的IFN-γ处理HepG2细胞48小时，LGALS3BP mRNA表达量与对照组相比提高2.87倍，但LGALS3BP表达量的变化对细胞增殖无显著作用；当过表达LGALS3BP时，在IFN-γ介导的抗HBV过程中，与对照组相比，HepG2.215细胞分泌的HBsAg、HBeAg以及细胞内HBV DNA和RNA的相对下降幅度分别为46%、67%、59%、49%；与对照组相比，转染pCH9-3091的HepG2细胞分泌的HBsAg、HBeAg以及细胞内HBV DNA和RNA的相对下降幅度分别为67%、53%、60%、29%；而当干扰LGALS3BP时，在IFN-γ介导的抗HBV过程中，与对照组相比，HepG2.215细胞分泌的HBsAg、HBeAg以及细胞内HBV DNA和RNA的相对上升幅度分别为46%、67%、59%、49%；与对照组相比，转染pCH9-3091的HepG2细胞分泌的HBsAg、HBeAg以及细胞内HBV DNA和RNA的相对上升幅度分别为67%、77%、67%、45%。结论：LGALS3BP作为正向调节因子参与IFN-?酌介导的抗HBV过程。     

应用慢病毒载体携带HBV基因组DNA制备乙型肝炎病毒感染小鼠模型的影响因素分析

应用慢病毒载体构建不同HBV转导质粒,通过高压水动力法尾静脉注射小鼠,比较不同HBV转导质粒、剂量(5μg和10μg)、小鼠品系(Balb/c和C57BL/6)及鼠龄(6周龄和18周龄)对建立HBV感染模型的影响。不同的时间点尾静脉采血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg的表达水平及动力变化,Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;免疫组织化学法检测肝组织HBcAg的定位与表达。1.3倍HBV基因组慢病毒载体转导质粒(pCSHBV1.3)优于1.1倍与1.2倍HBV基因组转导质粒(pCS-HBV1.1or pCS-HBV1.2);pCS-HBV1.3注射Balb/c小鼠后抗原表达维持时间短,抗体出现早;pCS-HBV1.3注射C57BL/6小鼠后,HBsAg、HBeAg抗原表达及血清HBV DNA水平维持时间长;且注射5μg质粒相对于10μg质粒注射小鼠后抗原表达维持时间更长;而6周龄和18周龄小鼠血清均可在较长时间内检测到HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,但在注射后35周内,前者的表达量均高于后者;所有注射质粒的小鼠肝组织中均可检测到HBcAg的表达,且在血清HBV感染标志转阴时均可检测到肝内HBV DNA的存在。注射质粒的HBV基因组长度、剂量以及宿主的遗传背景均对建立乙肝成体转基因小鼠模型有影响,且发现以5μg含1.3倍HBV基因组的转导质粒pCS-HBV1.3注射6周龄C57BL/6小鼠,HBV抗原表达和HBV DNA水平维持时间长,更适合建立HBV持续感染模型。     

反义RNA寡核苷酸及其与脂质体的复合物对于乙型肝炎病毒的抑制

我们设计合成了特异性靶向乙型肝炎病毒(HBV)mRNA的反义RNA寡核苷酸P-2987、X-60和X-519.在瞬时转染pHBV1.3质粒(含有1.3拷贝的HBV基因组)的HepG2细胞和整合了HBV基因组的HepG2.2.15细胞中,转染2μmol/L的反义RNA寡核苷酸,ELISA和实时定量PCR结果表明,这3条寡核苷酸可以明显抑制HBV的复制和抗原表达.在HBV转基因鼠中,尾静脉注射反义RNA寡核苷酸,结果表明,肝脏中HBV的复制得到了抑制,但是血清中抗原含量和HBV DNA拷贝数没有明显变化.反义RNA寡核苷酸X-519与脂质体的复合物可以增强其对于HBV在肝脏中复制的抑制作用.在通过高压尾静脉注射pHBV1.3质粒建立的HBV急性感染模型中,反义RNA寡核苷酸X-519可以显著地抑制HBV在肝脏中的复制以及降低血清中病毒抗原水平和DNA拷贝数.上述实验结果说明,X-519及其与脂质体的复合物对于HBV的复制和抗原表达起到明显的抑制作用,可能作为一种潜在的针对HBV的基因治疗药物.     

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库--共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。