去泛素化酶USP10通过稳定Smurf1抑制TGF-β/BMP信号通路

目的 探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法 利用GEO2R和Metascape对Usp10^+/+和Usp10^-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析，使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子的表达情况；进一步利用免疫印迹检测该信号通路，并通过基因芯片和免疫组化分析候选分子的表达情况；使用免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pull down实验验证USP10与候选分子的相互作用，通过泛素化实验明确USP10对底物分子的调控机制；利用免疫印迹检测细胞增殖、凋亡相关蛋白p21、Cleaved-caspase 3的表达情况，使用CCK-8和克隆形成实验分析USP10对细胞增殖的影响。结果 Usp10^-/-新生小鼠肾组织中TGF-β/BMP通路激活，USP10在小鼠体内缺失后导致Smad泛素相关因子1 (Smurf1)蛋白质水平降低，Smad1/5蛋白质水平上调，却不影响它们的转录水平；机制上，USP10与Smurf1存在相互作用，并依赖其去泛素化酶活性去除...     

CARP1基因克隆、表达及其泛素连接酶活性的鉴定

目的：克隆并表达caspase-8／10相关RING结构域蛋白1（CARP1）基因,检测其泛素连接酶活性。方法：提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果：免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1（RIP1）被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a（TNFa）引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论：构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响

目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性表达.结果 测序及酶切结果显示重组质粒pVAX1-Sp1构建成功;高表达sp1可使USP22启动子的转录活性降低（P＜0.01）.结论 成功构建了sp1真核表达质粒,sp1对USP22启动子具有转录抑制作用.     

USP22在转录调控及肿瘤发生中的作用

泛素特异性蛋白酶22（ubiquitin specific protease 22,USP22）是一种组蛋白去泛素化酶,在核受体介导的基因转录调控中起增强转录活性的作用。USP22在肿瘤发生、发展中发挥着重要作用,影响癌基因c-Myc介导的基因转录,从而促进肿瘤的增殖和生长;另一方面,USP22可改变远上游识别序列结合蛋白1（far upstream element—binding protein1,FBP1）的泛素化水平,从而影响FBP1下游的抑癌基因p21的表达。USP22与胃癌、大肠癌、乳腺癌及膀胱癌等肿瘤的病理进程相关。此外,USP22在端粒稳态的维持中起作用。本文主要综述USP22参与核受体介导的基因转录调控的表观遗传学机制及其在肿瘤发生中的作用。     

敲降VPS28基因对中国荷斯坦奶牛乳脂合成的调控

本课题组前期通过GWAS研究,发现VPS28基因在荷斯坦奶牛乳腺组织中特异性高表达,且其5′-UTR的突变位点-58C>T与乳脂性状关联,但其对乳脂性状的调控机理尚未明确。本研究为了明确VPS28基因及其突变位点-58C>T对乳脂的调控机理,首先利用启动子活性分析检测突变位点-58C>T对VPS28基因的影响,发现该突变位点显著降低VPS28基因启动子活性;然后利用RNA干扰技术敲降奶牛原代乳腺上皮细胞中VPS28基因表达量,检测VPS28通路和乳脂合成相关基因mRNA表达量以及细胞中脂肪滴形态,分析结果发现敲降VPS28基因可降低泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体通路基因和乳脂合成相关基因的表达量,并提高细胞中甘油三酯的合成,预示VPS28基因可能通过泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体途径调控乳脂生成。本研究结果在转录组水平揭示VPS28基因对乳脂合成的调控机制,为奶牛乳脂性状的分子育种研究提供参考依据。     

泛素化特异性酶（USP2a）与肿瘤发生的相关分子机制

去泛素化酶USP2a是去泛素化酶家族(DUBs)的一个成员,为半胱氨酸蛋白酶,是一种重要的特异性去泛素化水解酶。USP2a具有结构和功能多样性,其结构多样化使得这些酶具有一些特异性作用靶点,特别是在基因表达调控中靶向的生理底物种类繁多。特异性蛋白泛素化水平的动态变化涉及到基因表达活化和失活的多种机制以及信号通路转导的多个环节。越来越多的文献报道了去泛素化酶相互作用网络的组成及其重要性。USP2a调节多种重要的细胞生长和分化调节因子及信号转导因子的稳定性和功能,通过USP2a的去泛素化作用以及诱导它们之间相互反应对机体进行相应调控,特别是在调控转录因子、细胞周期和细胞凋亡自噬上发挥重要作用。USP2a的过表达在体内外都表现出致癌性,其靶蛋白通过各种途径影响肿瘤发生发展。通过对人类肿瘤发生发展的相关分子机制及信号通路影响的深入研究,USP2a有望成为肿瘤治疗的新靶点。现就去泛素化酶与人类肿瘤发生发展的相关分子机制及该领域的研究进展作一综述。     

非天然氨基酸突变的小鼠RANKL蛋白原核表达及抗血清制备

目的:研究非天然氨基酸突变的小鼠RANKL(m RANKL)蛋白的原核表达,并以表达的蛋白制备抗m RANKL蛋白的抗血清。方法:从小鼠的骨髓中提取总RNA,经PCR扩增m RANKL的胞外段,逆转录合成目的 DNA片段。将目的基因中编码第234位酪氨酸的密码子(TAT)突变成可编码非天然氨基酸p-硝基苯丙氨酸(p NO2Phe)的琥珀密码子(TAG),构建p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体,与p EVOL质粒共转化至表达菌E.coli BL-21(DE3),诱导表达并纯化。以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗m RANKL抗血清。采用ELISA测定抗血清效价,用Western Blot测定其特异性。结果:RT-PCR扩增出750bp的RANKL基因,并成功构建了p ET28a-p NO2Phe234m RANKL重组表达载体;p-硝基苯丙氨酸突变的m RANKL蛋白获得成功表达和纯化;以纯化的蛋白免疫小鼠,获得抗m RANKL抗血清,ELISA检测效价为1:6400,Western Blot结果显示该抗血清既可与p-硝基苯丙氨酸突变的m RANKL结合,也可与野生型m RANKL结合。结论:原核表达并纯化了p-硝基苯丙氨酸突变的m RANKL,制备了小鼠抗m RANKL的抗血清,为进一步研究阻断RANKL-RANK通路的新方法奠定了基础。     

冠状病毒PLpro蛋白酶对泛素样分子的DUB活性

SARS冠状病毒基因组中非结构基因nsp3编码的木瓜样蛋白酶 (PLpro) 在病毒基因组复制及逃避宿主天然免疫中发挥重要作用,是研发抗病毒药物的重要靶标．SARS冠状病毒PLpro是一种病毒编码的去泛素化酶 (DUB)．为深入研究SARS冠状病毒 PLpro对泛素样分子 (ubiquitin-like protein,UBL) 的DUB特性,本研究构建缺失 PLpro N末端泛素样结构域 (Ubl) 和下游跨膜结构域 (TM) 的PLpro构建体（constructs）,并构建3种缺失蛋白酶催化活性的突变体,检测PLpro对泛素样分子干扰素刺激基因15 (ISG15)及SUMO-1的作用．实验结果表明,PLpro和PLpro-TM 在细胞内具有很强的去ISG(DeISGylation) 活性;缺失PLpro N末端泛素样结构域(Ubl) 对PLpro 的去ISG15 活性没有影响;对PLpro蛋白酶活性位点C1651 和 H1812 突变后,PLpro-TM的去ISG15活性消失,而对D1826位点突变后不影响此活性．PLpro 不具有去SUMO (DeSUMOylation)活性,而PLpro-TM具有一定的去SUMO活性;PLpro催化活性相关的3个关键氨基酸残基 Cys-His-Asp突变后对去SUMO活性有一定的影响．研究结果提示,SARS PLpro除了具有DUB的活性,还具有体内去ISG活性和去SUMO活性;PLpro蛋白酶活性与其去ISG活性之间有一定相关性;PLpro去SUMO-1 活性具有TM 依赖性．SARS冠状病毒PLpro 对泛素样分子作用特性的研究为阐明病毒逃避宿主天然免疫机制和开发新型抗病毒药物提供重要的理论依据．     

变铅青链霉菌广谱胁迫蛋白对氧化压力响应的研究

【目的】广谱胁迫蛋白(USP)是一种古老的蛋白家族,在链霉菌属细菌中其功能研究尚未报道。以变铅青链霉菌USP蛋白为对象对其功能进行解析。【方法】使用序列比对的方法分析同源性及保守结构域。纯化USP蛋白,用圆二色谱分析蛋白与环腺苷酸(cAMP)的结合对usp(SLI_7517)进行基因中断。检测野生型和usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺造成的氧化压力的耐受能力。使用qPCR荧光定量分析技术,检测野生型菌株与usp缺失株在氧化环境中谷胱甘肽过氧化物酶及巯基过氧化物酶基因转录量的差异。【结果】同源序列分析表明链霉菌属来源的USP蛋白序列相互之间相似性较高,USP-like结构域高度保守。USP蛋白在体外结合cAMP引起CD谱的变化。usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺更耐受,同时菌株中谷胱甘肽过氧化物酶基因转录量上升。【结论】变铅青链霉菌中USP蛋白能够结合cAMP。usp参与菌体应对氧化环境的调控,对谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录有阻遏作用。     

范可尼贫血与泛素化

Fanconi贫血是一种罕见的隐性遗传性疾病,临床常以先天性畸形、进行性骨髓衰竭和遗传性肿瘤倾向为主要表现而确诊。FA病人细胞对DNA交联剂如丝裂霉素C (MMC)高度敏感。目前已经发现至少12种FA基因的缺失或突变能够引起FA表型的出现,其中10种相应的编码蛋白形成FA复合物共同参与FA/BRCA2 DNA损伤修复途径—FA途径。FA核心复合物蛋白FANCL具有泛素连接酶活性,在结合酶UBE2T共同作用下,催化下游蛋白FANCD2单泛化,泛素化FANCD2与BRCA2形成新的复合物,修复DNA损伤。去泛素化酶USP1在DNA修复完毕后移除FANCD2的单体泛素,使因损伤修复而阻滞的细胞周期继续进行。机体很可能在不同信号通路对FANCD2泛素化/去泛素化的精细调节下,调控FA途径参与不同的DNA修复过程。     

乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

目的:克隆编码人Ⅰ类乙醇脱氢酶基因,并探讨Ⅰ类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中的作用。方法:从胎儿肝,肾提取的总RNA;经RT-PCR扩增得到cDNA并克隆至pGEM-T载体。cDNA序列用Kpn I和Pst I酶切鉴定,并检测其在大肠杆菌中表达活性。通过吸光法检测酶的活性。结果:成功克隆了人Ⅰ类乙醇脱氢酶并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测其酶活性分别为0．81～1．31U/mg、0．09～0．15U/mg和0．76～1．11U/mg。结论:cDNA克隆成功,并发现其与肝脏中分离的酶具有相似的活性。     

去泛素化酶USP1的结构、功能及其抑制剂的研究进展

泛素化是一种维持细胞稳态必不可少的翻译后修饰,通过泛素分子与靶蛋白的连接参与蛋白质功能、定位和转换的调节。去泛素化酶介导的去泛素化为泛素化过程的逆反应,参与泛素的回收、编辑和重排。泛素特异性蛋白酶是最大的去泛素化酶家族,泛素特异性蛋白酶1 (USP1)是其中重要的亚型,广泛参与维持基因组完整性、细胞周期和细胞稳态。在多种肿瘤类型中均存在USP1异常表达,因此该靶点受到了广泛关注。目前研发进展最快的小分子USP1抑制剂为KSQ-4279,处于Ⅰ期临床研究阶段;另外ISM3091也已在国内和美国获得新药临床试验批件,即将开展临床试验。该文综述了USP1的结构、调控、生理功能、与肿瘤发生发展的关系以及USP1抑制剂的研究进展。     

NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶去泛素化酶活性和对宿主抗病毒天然免疫反应调节作用

引起人类呼吸道感染的冠状病毒已多达5种．冠状病毒与宿主相互作用决定了其致病性和免疫特性．冠状病毒感染后宿主会立即启动抗病毒天然免疫反应,而人类冠状病毒往往会编码特定蛋白逃逸或抑制宿主的天然免疫反应．NL63冠状病毒是一种新型人类冠状病毒,其非结构蛋白nsp3编码2个木瓜样蛋白酶(PLP)核心结构域PLP1和PLP2．前期研究发现,人类冠状病毒PLP2是一种病毒编码的去泛素化酶(DUB),但是对其DUB特性和功能还不清楚．研究发现,NL63冠状病毒PLP1和PLP2两个核心结构域中只有PLP2具有DUB活性,而且,PLP2的DUB活性对K48和K63连接的多聚泛素化修饰不表现明显特异性．同时,蛋白酶活性催化位点C1678和H1836突变后对其DUB活性有明显抑制作用,而蛋白酶活性催化位点D1849突变后对DUB活性无影响．其次,PLP2而非PLP1核心结构域能够明显抑制仙台病毒和重要信号蛋白(RIG-I、ERIS/STING/MITA)激活的干扰素表达,表明PLP2是一种冠状病毒编码的干扰素拮抗剂,而且PLP2的干扰素拮抗作用不完全依赖其蛋白酶活性．机制研究表明,PLP2能够与干扰素表达通路中的重要调节蛋白RIG-I和ERIS发生相互作用,通过对RIG-I和ERIS的去泛素化负调控宿主抗病毒天然免疫反应．此外,PLP2除利用DUB活性抑制干扰素表达外,很可能存在不依赖自身催化活性的其他组分共同抑制干扰素的产生．以上研究对阐明人类新发冠状病毒免疫和致病机理以及抗病毒药物研发具有重要参考价值．     

Adiponectin 基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.     

泛素特异蛋白酶4研究进展

泛素特异蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4,USP4)是一种重要的去泛素化酶,它通过识别特异性靶蛋白,使之去泛素化来阻碍其降解或改变其特性,在肿瘤、病毒感染及多种信号通路中发挥重要调节作用。但目前有关USP4在肿瘤形成和发展过程中究竟行使癌基因抑或是抑癌基因的功能尚存在争议。本文从USP4的结构、功能及信号通路等方面对其研究进展作一介绍。     

小鼠Mterf2基因cDNA的克隆、序列分析与组织表达特征

目的:克隆BALB/c小鼠线粒体转录终止因子2(Mterf2)基因cDNA编码区序列,分析Mterf2 mRNA和蛋白质在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、胰腺、肌肉和睾丸等9种组织中的表达情况。方法:以BALB/c小鼠肝组织总RNA为模板,RT-PCR扩增Mterf2基因cDNA编码区序列,将其克隆至pMD-19T载体,通过菌落PCR、双酶切和DNA序列测定进行验证;采用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树;通过Northern印迹和qRT-PCR方法检测Mterf2基因mRNA在小鼠各组织中的表达量;通过Western印迹检测MTERF2蛋白在小鼠多个组织中的表达量。结果:克隆获得BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,其全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,克隆到的序列与GenBank参考序列的同源性为100%,无任何碱基突变和移码突变。小鼠Mterf2基因与大鼠Mterf2基因的同源性最高,达到91.0%,在系统发生树上聚类为一簇。Mterf2基因mRNA和蛋白质在BALB/c小鼠心、脑、肝和肾等新陈代谢旺盛的组织中表达丰度最高,其次是在胰腺、睾丸和肌肉组织,而在脾和肺组织中表达相对较低。结论:克隆了BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,并进行了多种组织的表达特征分析,为后续研究Mterf2基因在实验动物体内的生理功能奠定了基础。     

去泛素化酶与伴侣分子互作的病理生理及研究进展

去泛素化酶(DUBs)通过逆转泛素激活酶(E1)-泛素结合酶(E2)-泛素连接酶(E3)介导的泛素化过程,参与包括DNA复制、DNA损伤修复、炎症、贫血、凋亡、内吞等机体的生理病理过程。USP52,USP25,USP19属DUBs中的泛素特异性水解酶家族(USPs),与不同的伴侣分子相关联,USP52可去泛素化伴侣分子ASF1A,促进组蛋白H3-H4二聚体入核和DNA复制、修复顺利进行,两者高表达可使肿瘤的增殖能力和DNA损伤耐受性增强。USP52(别名PAN2)又可与PAN3形成复合物参与mRNA的代谢。牛痘相关激酶(VRK2)调节USP25的活性,影响后者对伴侣分子TRiC的稳定性,进而影响蛋白错误折叠。USP19(b亚型)和Hsp90,CHIP(E3连接酶)形成复合物调节错误折叠蛋白的命运。本文系统综述了去泛素化酶(DUBs)家族相关成员及其通过与伴侣分子相互作用在肿瘤等疾病的发生发展中所起的作用及其相关研究进展。     

USP18介导的蛋白质去ISG化及其在结核病等传染病中的作用

干扰素诱导基因15 (interferon-stimulated gene 15,isg15)的表达受Ⅰ型干扰素诱导,该基因编码的蛋白ISG15可以分别通过E1、E2和E3酶的作用共价修饰靶蛋白,此过程被称为ISG化(ISGylation)。宿主蛋白的ISG化广泛参与天然免疫例如宿主的抗病毒过程。泛素特异性蛋白酶18 (ubiquitin-specific protease 18,USP18)作为一种去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)可以去除靶蛋白偶联的ISG15,并通过抑制Ⅰ型干扰素信号通路来抑制宿主的免疫应答。ISG15介导的ISG化和USP18介导的去ISG化(deISGylation)建立的动态平衡对结核病的发生、发展和转归有重要影响。此外,同ISG15一样,USP18也广泛参与病毒感染和宿主细胞抗病毒反应,多种先天性免疫疾病和免疫信号通路都受到USP18的调节。本文综述了ISG15和USP18相关的研究进展,重点介绍了ISG15介导的ISGylation和USP18介导的去ISG化在结核病及其他重要疾病中的调控作用,以期为靶向宿主蛋白的结核病等重要疾病防治提供...     

转人P301L突变tau基因小鼠学习记忆功能与与脑内NO的改变

目的:探究第十代转人P301L突变tau基因小鼠(F10)学习记忆障碍的机制。方法:Western blot法检测F10代小鼠人tau蛋白的表达与tau蛋白磷酸化水平的改变;Bielshowsky法银染脑片显示神经纤维缠结;旷场实验与避暗实验检测小鼠学习记忆能力的改变。比色法检测小鼠全脑乙酰胆碱水平,胆碱乙酰转移酶活性与胆碱酯酶活性变化;硝酸还原酶法检测小鼠全脑一氧化氮水平的改变。结果:转人P301L突变tau基因小鼠可表达外源人tau蛋白,3月龄小鼠大脑皮层和海马中出现tau蛋白磷酸化水平明显升高及7月龄小鼠皮层形成神经纤维缠结和出现学习记忆障碍;转人P301L突变tau基因小鼠全脑乙酰胆碱水平,胆碱酯酶活性和胆碱乙酰转移酶活性及表达均未见明显改变;但该小鼠全脑一氧化氮水平却明显下降。结论:F10代转人P301L突变tau基因小鼠仍可遗传亲本性状,7月龄小鼠同时出现学习记忆障碍与全脑一氧化氮含量明显下降的现象,提示转人P301L突变tau基因小鼠全脑一氧化氮含量下降可能涉及其学习记忆障碍机制。     

甜菜夜蛾拓扑异构酶I氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响

【目的】为了探究甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 拓扑异构酶I（topoisomerase I, Top I）氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响。【方法】通过克隆甜菜夜蛾 Top I 基因,构建原核表达载体,采用完全重叠PCR定点突变技术,向甜菜夜蛾Top I 的V420, L530, A653和S729（根据人Top I 氨基酸序列编号）4个位点引入突变,将改造成功的重组 Top I 基因转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,诱导重组蛋白表达、纯化,测定Top I突变对其解旋活性的影响。【结果】完全重叠PCR能实现甜菜夜蛾 Top I 定点突变。重组蛋白在体外得到稳定的表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析在96.0 kDa处出现特异性条带。通过对重组蛋白分离纯化并测定对质粒pBR322解旋酶活性,发现引入V420I, L530P和A653T突变后Top I的比活力显著降低,而引入S729T突变后比活力与野生型蛋白无显著差异。【结论】本研究证明在甜菜夜蛾Top I中引入V420I, L530P和A653T突变后,其对底物pBR322的解旋活性显著降低,为后期探索甜菜夜蛾Top I的定点突变与其对喜树碱及其衍生物敏感性的关系奠定了基础。