鳜亚科SINIPERCINAE鱼类的分类整理和地理分布

鳜亚科鱼类仅产于东亚。通过对中国各地、日本和朝鲜标本的研究,本文把鳜亚科鱼类总结为鳜、长体鳜和少鳞鳜3属11种,还对过去一些种的异名作了讨论,提出了看法。 本亚科共有3属9种分布于中国,另两种少鳞鳜只见于日本和朝鲜,是日本和朝鲜地区的特有种。越南有3种记录(Mai,1978)。其中鳜鱼和斑鳜分布最北,是横跨东洋地区和古北区的两个广布种。其他各种皆集中分布于江、淮流域以南,主要在长江流域以南和红河流域以东,但台湾省无鳜类分布。长江流域以南低纬度的华南区是鳜亚科鱼类的分布中心。     

鳜类系统发育的线粒体Cytb基因全序列分析

测定了鳜、大眼鳜、斑鳜、暗鳜、波纹鳜、长体鳜、中国少鳞鳜等7种鳜类12个个体的线粒体细胞色素b基因全序列。结合GenBank中的同源序列,共分析了9种鳜类的系统发育关系。序列分析表明,鳜属鱼类属内种间的遗传距离(0.015～0.093)明显小于少鳞鳜属鱼类属内种间的遗传距离(0.152～0.178)。在分子系统发育树上,长体鳜与鳜属的鳜、大眼鳜、斑鳜、波纹鳜、暗鳜聚合成一分支,少鳞鳜属的种类聚成另一分支;支持将长体鳜归入鳜属,鳜类分为鳜属和少鳞鳜属等二个属的分类处理。在鳜属鱼类中,鳜和大眼鳜亲缘关系十分密切;斑鳜与波纹鳜亲缘较近;长体鳜与鳜属其它5个种的亲缘关系较远。在少鳞鳜属鱼类中,中国少鳞鳜和日本少鳞鳜的亲缘关系较远,韩国少鳞鳜的系统位置较不明确。鳜类的单系性及其鳜类的系统位置仍有待进一步研究。     

鳜类鱼类的线粒体DNA控制区结构及其系统发育分析

鳜类为低等鲈形目鱼类,是东亚特有类群。然而,关于其系统位置、分类以及一些物种的有效性等尚有争议。采用PCR扩增直接测序的方法,获得了鳜、大眼鳜、斑鳜、暗鳜、波纹鳜、长体鳜、中国少鳞鳜线粒体DNA控制区基因的序列。对比其他已报道鱼类控制区的结构识别序列,对鳜类鱼类控制区的结构进行了分析,识别了终止序列区、中央保守区和保守序列区,并找到了DNA复制终止相关的序列ETAS和中央保守区的保守序列CSB-F、CSB-E、CSB-D以及保守序列区的保守序列CSB1、CSB2、CSB3。几种鳜鱼间共有191个变异位点,其中,终止序列区的变异最高,占总变异的61．3％,中央保守区和保守序列区占总变异的38．7％。这一结果可为全面了解鱼类线粒体DNA控制区的结构特征提供资料。同时,利用高度变异的控制区序列,以鲈科和错科作为外群,使用邻接法和最大简约法构建了这几种鳜鱼的系统发育树。结果表明：鳜类为一单系类群,鳜、大眼鳜、斑鳜、暗鳜、波纹鳜、长体鳜构成一支鳜鱼群,其中,鳜与大眼鳜为姐妹种;中国少鳞鳜为另一支少鳞鳜群;长体鳜未单独成一支,而是聚入鳜鱼群内,应更名为Siniperca roulei。研究结果支持将现生鳜类分为两个类群的观点。     

斑鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其纵向表达分析

从斑鳜(Siniperca scherzeri)背部白色肌肉组织中提取总RNA,利用RT-PCR法克隆到斑鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2)(GenBank:GQ283000).斑鳜MLC2基因cDNA序列的开放阅读框的长度为513 bp,编码170个氨基酸,理论相对分子质量为19 105.61 Da,等电点为4.73.该开放阅读框具有4个EF-手相结构.斑鳜MLC2推导的氨基酸序列与已报道的其它6种鱼类MLC2氨基酸序列同源性在89%以上,其中与Ca2+结合的区域非常保守,氨基酸序列同源性为100%.用实时荧光定量PCR对斑鳜MLC2纵向表达分析显示,MLC2在斑鳜背肌的前部、中部和后部都有表达,但无显著差异.     

斑鳜不同地理群体遗传变异的AFLP分析

斑鳜（Siniperca scherzeri Steindachner）为东亚地区特有的淡水名贵经济鱼类。受生态环境破坏和渔业捕捞过度的影响,斑鳜野生资源已呈下降趋势。为探明我国斑鳜不同地理群体的遗传背景,采用AFLP分子标记技术研究了鸭绿江、海河、长江、钱塘江、闽江、西江6个地理群体的遗传特征和群体分化。斑鳜65尾个体中,8对引物组合共扩增出211条带,其中多态性条带126条,多态比例为59.7％,并观察到一些群体的特异性条带。群体内的遗传变异以长江群体最大（6.7％）,群体间的遗传距离明显大于群体内的遗传距离。AMOVA分析表明,斑鳜6群体间的总遗传分化指数Fst= 0.7850（p <0.01）,群体间遗传分化极显著。聚类分析表明：斑鳜不同群体内的所有个体均单独聚群,6个地理群体明显分为南北两大群,鸭绿江群体和海河群体聚为一支,长江、钱塘江、闽江和西江四个群体聚为另一支。斑鳜较高水平的遗传变异与其地理分布范围广,在不同的生态环境下积累了的大量突变有关。不同地理群体间已产生了明显的遗传分化,其遗传亲缘关系与其地理分布格局基本一致,推测横亘于我国内陆中部地区、呈东西走向的秦岭山脉的形成可能是东亚斑鳜最先出现南北间群体分化的主要原因。     

鳜亚科鱼类地理分布的研究

(一)鳜类鱼在中国古文献中的记载 鳜音gui(集韵),亦音jue(广韵,集韵),今通读gui.亦名罽(ji)、石桂鱼、水豚、(鱼季)花鱼、鳌花鱼。鳜字最早见于公元2200年前的《山海经》,称“洛水多鰧鱼,状如鳜”及《尔雅·释鱼》“(鱼矞)(yu)(鱼夸)(bu)鳜(鱼帚)(zhou)”;但尔雅中的鳜郭璞注音厥(iue),指(鱼旁)鮍鱼类而言。以后记载甚多,如梁顾野王(公元519—581)《玉篇》称鳜“鱼,大口,细鳞,斑彩”。唐、宋各家本草内常有记述。明张自烈《正字通》称“鱼,扁     

斑鳜不同地理群体遗传变异的AFLP分析

斑鳜（Siniperca scherzeri Steindachner）为东亚地区特有的淡水名贵经济鱼类。受生态环境破坏和渔业捕捞过度的影响,斑鳜野生资源已呈下降趋势。为探明我国斑鳜不同地理群体的遗传背景,采用AFLP分子标记技术研究了鸭绿江、海河、长江、钱塘江、闽江、西江6个地理群体的遗传特征和群体分化。斑鳜65尾个体中,8对引物组合共扩增出211条带,其中多态性条带126条,多态比例为59.7％,并观察到一些群体的特异性条带。群体内的遗传变异以长江群体最大（6.7％）,群体间的遗传距离明显大于群体内的遗传距离。AMOVA分析表明,斑鳜6群体间的总遗传分化指数Fst= 0.7850（p <0.01）,群体间遗传分化极显著。聚类分析表明：斑鳜不同群体内的所有个体均单独聚群,6个地理群体明显分为南北两大群,鸭绿江群体和海河群体聚为一支,长江、钱塘江、闽江和西江四个群体聚为另一支。斑鳜较高水平的遗传变异与其地理分布范围广,在不同的生态环境下积累了的大量突变有关。不同地理群体间已产生了明显的遗传分化,其遗传亲缘关系与其地理分布格局基本一致,推测横亘于我国内陆中部地区、呈东西走向的秦岭山脉的形成可能是东亚斑鳜最先出现南北间群体分化的主要原因。     

斑鳜myostatin基因及其启动子的克隆与序列分析

采用Tail-PCR和常规PCR技术首次克隆出斑鳜myostatin基因及其启动子序列。经生物信息学分析发现,斑鳜myostatin基因由3个外显子和2个内含子组成,编码区1131bp,共编码376个氨基酸。斑鳜myostatin启动子区域大小为840bp,存在1个TATAA-box、4个E-box和1个CAAT-box作用元件。利用软件CLUSTALW和MEGA3.1构建14种硬骨鱼的myostatin启动子的系统进化树结果表明:斑鳜同大口黑鲈亲缘关系最近,与鲤鱼和缨野鲮亲缘关系较远,其结果与传统形态学分类中的亲缘关系一致。斑鳜myostatin基因及其启动子克隆与特征分析,将为进一步研究鱼类myostatin基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

鳜牙齿形态结构及与不同种属间比较观察

牙齿是肉食性鱼类重要的摄食器官。为探究鳜(Siniperca chuatsi)牙齿形态结构,采用解剖镜观察了鳜牙齿分布、形态与数量。并比较其与大眼鳜(S. kneri)、斑鳜(S. scherzeri)及中国少鳞鳜(Coreoperca whiteheadi)牙齿差异。采用茜素红染色、组织切片、扫描电镜、X射线能谱及红外光谱观察并检测了鳜牙齿结构、元素组成和化学成分。结果显示,鳜牙齿具上颌齿、下颌齿、犁齿、腭齿和咽齿。其中,上颌齿前端有犬齿,其余为绒毛状齿;下颌齿最内列有犬齿,其余为绒毛状齿;犁齿、腭齿、咽齿均为绒毛状齿。鳜和大眼鳜下颌齿列数为3列,斑鳜和中国少鳞鳜为4列。茜素红染色显示,犬齿和绒毛状齿外层均为透明的牙釉质,内层为包裹髓腔的牙本质;组织切片显示,牙本质结构疏松,内有许多孔隙;牙尖部分形成牙釉质帽;中央为髓腔,内有牙髓组织。扫描电镜显示,犬齿和绒毛状齿表面均由釉柱组成,釉质层有釉柱横纹。X射线能谱显示,犬齿和绒毛状齿主要元素都为碳(C)、氧(O)、氮(N)、钙(Ca)和磷(P)。红外光谱显示,犬齿和绒毛状齿主要无机成分为碳酸羟基磷灰石。结果表明,鳜牙齿较发达,上、下颌齿有犬齿,犬齿和绒毛状齿结构与组成基本相似。     

基于细胞色素b基因序列的东亚鳜类系统发育关系

鳜类为东亚特有类群。为验证东亚鳜类的单系起源,解决其分类划分的争议,本文采用特异性引物PCR扩增法获得了鳜类中鳜、大眼鳜、斑鳜、暗鳜、波纹鳜、长体鳜细胞色素b基因的全长序列,结合GenBank中日本少鳞鳜、朝鲜少鳞鳜和中国少鳞鳜的序列,初步构建了东亚鳜类种间的系统发育关系。NJ树和MP树均一致表明,鳜类为单系类群,可分为两支:鳜鱼群和少鳞鳜群。长体鳜未单独成群,而与鳜鱼属聚为一支,不支持将长体鳜单独设属,而应归入鳜鱼属。鳜鱼群中,MP树推测的长体鳜、暗鳜较为原始,鳜、大眼鳜、斑鳜和波纹鳜为特化种类的系统关系假设与其形态、生态特征表型进化较为一致。少鳞鳜群中,中国少鳞鳜与朝鲜少鳞鳜为姐妹种,再与日本少鳞鳜构成姐妹群的系统关系与其地理分布格局较为一致。本研究结果可为深入探讨鳜类物种有效性、系统分类位置及生物地理学提供依据。     

大眼鳜头骨形态的观察

通过对大眼鳜头骨的形态学观察表明,大眼鳜头骨由134块硬骨和3块软骨组成,其中脑颅38块,咽颅硬骨96块,软骨3块.同时将大眼鳜头骨与鲈鱼头骨进行了比较分析,两者既具有极大的相似性,又有较为显著的差异.探讨了大眼鳜头骨形态结构与其功能适应性.     

Genetic population structure in Siniperca scherzeri (Perciformes: Siniperca) in China inferred from mitochondrial DNA sequences and microsatellite loci

This study aims to improve the estimates of fine-scale genetic diversity and to compare the population structure of Siniperca scherzeri with nuclear and mitochondrial DNA (mtDNA) markers. We first combined mtDNA sequences and seven microsatellite loci to examine the genetic diversity of S. scherzeri in China. Phylogenetic and nested clade analyses revealed two major mtDNA lineages and four subclades. Bayesian multilocus genotype clustering from the microsatellite loci revealed that regional divergence estimates were quantitatively congruent between marker classes. These lineages should be recognized as the basic evolutionary significant units for S. scherzeri in China. Contradict to the previous studies on Coreoperca whiteheadi and Siniperca chuatsi, neither the Nanling–Wuyi Mountain range nor the Qingling–Dabie Mountain range represented a major phylogeographic barrier for S. scherzeri. Our fine-scale analyses of the genetic population structure of S. scherzeri provided insights into the evolutionary processes that shaped the genetic heterogeneity of this fish. This study may serve as a basis for the protection, monitoring and breeding improvement of germplasm resources of this commercially important fish.     

Long-term cryopreservation of sperm from Mandarin fish Siniperca chuatsi

In order to develop cryopreservation techniques for long-term preserving the sperm of Mandarin fish Siniperca chuatsi, we examined the effects of various extender and cryopreservation on post-thaw motility. We found the optimal freezing procedures for the Mandarin fish sperm is diluting the semen in D-15 extender, chilling it to 4 degrees C, adding ME2SO to a final concentration of 10% (v/v), then transferring the semen in cryotubes, holding the cryotubes for 10 min at 6 cm (about -180 degrees C) above the surface of liquid nitrogen, for 5 min on the surface of liquid nitrogen, and finally plunged into liquid nitrogen. After thawed at 37 degrees C for 60s, the sperm had the highest post-thaw motility (96.00+/-1.73%). The optimal fertilization procedures for the frozen sperm is mixing the eggs with sperm, then adding 1 ml of swimming medium (SM=45 mM NaCl+5 mM KCl+20mM Tris-HCl, pH 8.0) immediately. At the sperm/egg ratio of 100,000:1, the fertilization rate and the hatching rate of the frozen sperm cryopreserved for 1 week or 1 year in liquid nitrogen (66.01+/-5.14% and 54.76+/-4.40% & 62.97+/-14.28% and 52.58+/-11.17%) were similar to that of fresh sperm (69.42+/-8.11% and 59.82+/-5.27%) (p>0.05). This is the first report that the Mandarin fish (S. chuatsi) sperm can successfully fertilized eggs after long-term cryopreservation.     

qRT-PCR分析鳜鱼内参基因的筛选

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)准确性的首要条件。本实验采取鳜鱼8个不同胚胎发育阶段、5个胚后发育时期和8个成鱼组织为研究对象,应用qRT-PCR技术,分析了RPL13、RPL19、EF1a、RPL13a、B2M、hprt1和rps29七个内参基因的表达稳定情况。经GeNorm软件分析发现,B2M和RPL13a在鳜鱼成鱼不同组织中表达最稳定;在胚后不同时期中表达最稳定的是EF1a和RPL13a;EF1a和B2M是在不同胚胎发育阶段中表达最稳定的两个基因。根据内参基因标准化因子的配对差异分析V_(n/n+1),在鳜鱼不同组织和不同发育阶段中,均使用两个最稳定表达的内参基因即可达到准确校正的目的。因此,该实验结果为鳜鱼基因表达分析时内参基因的选择提供了参考。     

鳜源致病性荧光假单菌的分离与鉴定

为确定导致鳜（Siniperca chuatsi）细菌性感染死亡的病原,从患病濒死的鳜肝中分离出一株优势菌B01,经人工回感实验确定其分离菌的致病性,并利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪及16S rRNA序列分析对纯培养细菌进行鉴定。此外,对分离的菌株进行药敏实验。研究结果表明,菌株B01对鳜鱼具有致病性。经VITEK-2全自动微生物鉴定仪鉴定菌株B01为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（表1）,并在紫外灯可以产生荧光（图1）。进一步的16S rRNA基因序列和系统发育树分析表明,该菌与荧光假单胞菌同源性达到了97%以上,并和（图2）。药物敏感性实验结果显示,该分离株对恩诺沙星、诺氟沙星、链霉素和四环素药物等6种药物高度敏感（表2）。     

鳜嗅囊组织结构与早期发育北大核心CSCD

本研究采用组织切片和免疫组织化学方法以及扫描电镜和透射电镜观察并描述了鳜(Siniperca chuatsi)嗅囊组织结构特征和早期发育过程。结果显示,鳜具有2对鼻孔,前后鼻孔紧密相连,具有皮瓣。嗅囊位于嗅腔内,由16~20个初级嗅板构成,为G型嗅囊,初级嗅板通过褶皱产生次级嗅板。嗅板远端边缘为非感觉区,感觉区主要位于嗅板中端和近端。嗅上皮细胞可分为6类,即纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞、微绒毛感觉细胞、支持细胞、基细胞和黏液细胞。从仔鱼到幼鱼阶段,1~7日龄仔鱼嗅基板较薄,表面有纤毛,10日龄嗅窝内陷并形成嗅腔,26日龄稚鱼形成第1对初级嗅板,55日龄幼鱼形成8对初级嗅板。55日龄前,鳜嗅囊发育较迟缓,初级嗅板侧向平行排列,尚未形成次级嗅板。     

鳜早期色素发育和色彩图案的形成

色彩图案作为最显著的外部形态特征之一,在动物生存与交流中起着重要的作用。为了解鳜(Siniperca chautsi)早期发育过程中这一形态特征变化,采用CCD-Adapter解剖镜对鳜早期(胚胎期至出膜40日龄)体表色素细胞种类与分布、主要图案(条、带、斑)的形成过程进行了观察,同时对不同部位皮肤进行组织切片观察。结果显示,胚胎期,最早观察到黑色素细胞,位于卵黄囊和油球,出膜前,头部出现黄色素细胞;出膜后,黑色素细胞发育最为显著,红色素细胞出现在眼球后部和躯干前部;5日龄后,黄色素细胞发育增加,鱼体各部位均有分布,黑色素细胞继续发育,图案形成开始。鳜早期色彩图案形成过程:(1)躯干纵带:5日龄,背部出现少量黑色素,14日龄,背鳍基部黑色素与腹部黑色素相连;(2)头部过眼条带:10日龄,鳃盖后上方黑色素明显增多,12日龄,眼球后部经鳃盖后上缘至背部前端的条带形成,17日龄,上颌至眼球前部的条带形成;(3)头顶条带:6日龄,头顶正上方黑色斑点增多,18日龄,头部上方黑色斑块分别向前、后延伸,23日龄,头顶正上方黑色条带基本形成;(4)躯干斑块:8日龄,尾部底端出现一个较小的黑色斑块,15日龄,尾柄前部出现3个不规则黑色斑块,25日龄,躯干中后部5个近圆形黑色斑块形成。结果表明,鳜胚胎期至出膜40日龄,体表出现黑色素细胞、黄色素细胞和红色素细胞,体色以黑色为主,主要条带或斑块在仔鱼5日龄后按不同方式逐渐形成,不同皮肤部位的色素层组成与分布方式不同。     

鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验

【目的】通过对从患病的鳜(Siniperca chuatsi)肝脏中分离得到的一株优势菌WJ2014-1进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后鳜维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病鳜肝脏分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S r RNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】用菌株WJ2014-1进行人工回归感染试验后,鳜发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S r RNA基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌。该菌株对复方新诺明、强力霉素、罗红霉素、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种抗生素耐药。【结论】分离得到的菌株WJ2014-1对鳜有致病性,生产中可选用复方新诺明、强力霉素、罗红霉素等药物进行防治。