小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

呼肠孤病毒Ⅲ型（Re03）RT—PCR检测方法的建立

目的建立呼肠孤病毒Ⅲ型（Re03）RT—PCR检测方法,应用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Re03的检测。方法根据已发表的呼肠孤病毒Ⅲ型（Re03）M1基因序列,设计合成引物。提取Re03细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、重复性试验。结果建立的Re03RT—PCR检测方法特异、敏感、稳定。以Re03RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为0．42pg／μL,可检测病毒最小滴度为10^-9／mL。结论建立的呼肠孤病毒Ⅲ型（Re03）RT—PCR检测方法可用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Re03的检测。     

乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。     

痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备

目的测试痘苗病毒毒力,制备痘苗病毒免疫血清,为药物评价和病毒检测奠定基础。方法鸡胚绒毛尿囊膜培养痘苗病毒,测定病毒的TCID50和小鼠毒力。将痘苗病毒悬液稀释成100TCID550,0．2％福尔马林灭活,分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫BALB／c小鼠,用IFA、IEA、ELISA方法评价血清的敏感性和特异性。结果痘苗病毒TCID50／0．05mL=1．8×10^4,小鼠LD50／0．2mL=10^6.8;制备的免疫血清经IFA法测定效价为1：320,IEA法测血清效价为1：160,ELISA测血清效价1：6400。结论确定的细胞和小鼠毒力将为药物测定提供基础比对数据;制备的痘苗病毒免疫血清具有高度的敏感性和特异性,可作为测试对照血清使用。     

犬瘟热病毒（CDV）ELISA检测方法的建立与应用

目的建立犬CDV抗体ELISA检测方法。方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为1∶32 000、10μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒（CPV）、犬肝炎病毒（ICHV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于犬CDV抗体的检测。     

RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50。方法用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50。结果本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒。RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变。RT-SHIV（PBMC）和RT-SHIV（CEMx174）病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL。结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性。     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M.RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表达M基因的mRNA和M蛋白.纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8TCID50/mL.动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人 血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M。RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表 达M基因的mRNA和M蛋白。纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8 TCID50／ mL。动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd-M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应 答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒（PPV）杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

小鼠脑脊髓炎病毒标准血清制备及间接ELISA检测方法的应用

目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清,建立ELISA检测方法,实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠,制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠,免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定;TMEV感染BHK-21细胞,制备EHSA抗原,确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度,建立TMEVEHSA检测方法,进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清,以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320,与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应;建立了ELISA检测方法,确立了各种试剂的最佳工作浓度,其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000,抗原为2.5μg／mL,阳性参考血清为1：200;EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％,板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清;建立的ELISA方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。     

桂皮醛衍生物的合成及其对CVB_3的作用

目的：合成桂皮醛衍生物,观测其对心肌细胞的毒性及抗CVB3病毒的作用。方法：化学合成6种桂皮醛衍生物,其中3种进行了红外、质谱等结构表征;MTT法检测被CVB3病毒感染和用桂皮醛衍生物治疗后的心肌细胞活性。结果：α-溴代对氯肉桂醛、α-溴代对甲基肉桂醛、对氯肉桂醛3种桂皮醛衍生物对心肌细胞的半数毒性浓度（TC50）分别为2151.28μg·mL-1,1475.32μg·mL-1,22460.32μg·mL-1;对CVB3病毒的半数抑制浓度（IC50）分别为178.94μg·mL-1、173.35μg·mL-1、6045.25μg·mL-1;对CVB3病毒的治疗指数（TI）分别为12.02,8.51,3.71。结论：桂皮醛3种衍生物具有直接抑制CVB3病毒作用,但对病毒的细胞合成和吸附无明显作用。     

HPLC法同时测定鸡矢藤中熊果酸和齐墩果酸的含量

目的：建立高效液相色谱法同时测定鸡矢藤中熊果酸和齐墩果酸的含量。方法：色谱柱为DiamonsilTM C18（250×4.6 mm,5滋m）,流动相为甲醇-0.05mol.L-1磷酸溶液（93∶7）为流动相,检测波长210 nm,进样量10滋L。结果：熊果酸在21.28滋g.mL-1～212.8滋g.mL-1范围内线性关系良好（r=0.9997）,平均回收率为97.79%（RSD=1.30%）;齐墩果酸在24.02滋g.mL-1～240.2滋g.mL-1范围内线性关系良好（r=0.9996）,平均回收率为98.36%（RSD=1.11%）。结论：该方法简便、灵敏、准确,可用于鸡矢藤药材的质量评价。     

双抗体夹心法检测3-硝基酪氨酸方法的建立及应用

目的：建立一种准确、快速的双抗体夹心酶免疫吸附的方法,以定量检测组织中过氧亚硝基阴离子的水平。方法：分别以小鼠源性抗3-硝基酪氨酸单克隆IgG抗体和兔源性抗3-硝基酪氨酸IgG抗体为包被抗体和检测抗体,采用正交设计方法摸索以上各抗体的浓度,建立定量检测3-硝基酪氨酸（3-NT）的双抗体夹心ELISA法。同时,测定心肌缺血再灌注大鼠心肌组织3-NT的含量。结果：本研究建立的双抗体夹心ELISA法检测3-NT的最低检测下限为0．10ng·ml^-1,具有良好线性关系的检测范围是（0．15-7．50）ng·ml^-1（r^2=0．995）;心肌缺血再灌注组大鼠的心肌组织中的3-NT水平为（1022．42±97．35）ng·mg pro^-1,明显高于假手术组（246．58±56．52ng·mg pro^-1,P〈0．01）。结论：本研究建立的定量检测3-NT的双抗体夹心ELISA法能够方便、准确、快速地检测组织中3-NT的含量,为定量检测组织中ONOO-的水平提供了新的方法。     

免疫荧光法检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白VP4

目的：用免疫荧光法快速检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒（RV）外壳蛋白VP4。方法：以抗VP4的抗体为一抗、FITC标记的羊抗豚鼠IgG为二抗,用免疫荧光方法检测在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达的同源RVVP4;检测SA11或Wa株RV感染MA104细胞后不同时间段病毒VP4的合成及其在感染细胞中的分布情况。结果：用免疫荧光法可直接检测到原核细胞中表达的外源蛋白,也可检测到病毒蛋白在真核细胞中的分布情况。结论：免疫荧光法可特异、方便、快速地检测RV VP4在原核和真核细胞中的表达;来源于RV TB—Chen株的VP4抗体可特异性识别同源病毒VP4,交叉识别SA11或Wa株的VP4。