土拉弗氏菌的分子生物学及检测

土拉热是一种典型的人兽共患疾病,作者在查阅大量资料的基础上,对土拉弗氏菌分子生物学及其检测方面的最新进展作了综述。     

土拉弗氏菌研究进展

1概述土拉弗氏菌（Francisellatularensis,处称土拉菌）是引起土拉菌病（或称土拉热）的病原体。1912年McCoy在美国西部加里福尼亚州研究黄鼠鼠疫时首次在土拉县（Tulare）,从黄鼠（Citellusbeecheyi）分离出一株新苗种,根据该地地名命名为上拉菌（Bacteriumtularensis）。因     

土拉弗朗西斯菌检测研究进展

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是土拉菌病（Tularemia）的致病菌,是最具传染性的致病菌之一,在自然界中已发现一百种以上的动物感染此菌。因其传播途径多样,易扩散、毒性强而被美国疾病控制预防中心列入A类生物恐怖制剂。土拉菌病是一种人畜共患病,致死率高,及时、准确的检测土拉菌对于土拉菌病患者及时治疗和防止扩散具有重要的意义。土拉菌检测方法很多,如菌培养,微凝集实验、酶联免疫吸附、快速检测试纸条、生物传感器、PCR、核酸杂交检测、质谱分析、基因芯片等。但到目前为止还没有一种成熟的用于土拉菌检测方法,其主要原因在于土拉菌致病性强,且不易分离培养。本文综述了土拉菌细菌学、免疫学、分子生物学方法检测的最新研究进展。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变株的构建

目的:构建弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变体,以研究yciD基因的功能。方法:根据弗氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用Red重组系统对yciD基因进行缺失,并经PCR和SDS-PAGE证实;对野生株和突变株的生长状态及生化反应进行比较研究。结果:构建了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株2457TΔyciD,该突变株外膜蛋白样品中缺失了一条相对分子质量与从yciD基因推导的蛋白相当(约22000)的蛋白带。该突变株比野生株生长快,利用葡萄糖和甘露醇的能力也比野生株大为增强。结论:获得了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株。     

PCR和Southern Blot检测土拉弗氏菌气溶胶

为提高检测土拉弗氏菌的特异性和敏感性,建立了土拉菌ＰＣＲ及核酸杂交检测方法。运用平板计数、多聚酶链反应对土拉菌气溶胶稳定性进行了比较,结果表明ＰＣＲ具有较高灵敏度,并且在采样后３小时ＰＣＲ就可以得出定性结果,而平板计数则需要３～７天。采用ＰＣＲ法合成了土拉菌３７６－ｂｐ探针,分别对细菌菌液、５６８－ｂｐＰＣＲ产物和气溶胶样品进行杂交,结果表明菌悬液直接杂交可检出１０５ＣＦＵ左右的细菌,检测ＰＣＲ产物可达４０ｐｇ。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹相结合有利于细菌的分离鉴定     

新一批土拉热弗朗西斯活疫苗株接种后的安全性、反应原性、皮肤摄入反应和抗体应答

正土拉热病是由土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)引起的,该革兰阴性细菌已经被制作成气溶胶式的生物武器。为了保护进行生物防御研究的人员,美国陆军要求对根据现行GMP生产的土拉热新批次活体疫苗株进行临床评估。Ⅱ期临床随机试验比较了新批次(DVC-LVS)与已使用数十年的现有疫苗(USAMRIID-LVS)。这些疫苗通过划痕接种于228名参与者。分别在第     

弗氏2a志贺菌2457T株碱性蛋白质组图谱的建立

目的:建立弗氏2a志贺菌2457T株的碱性蛋白质组图谱。方法:首先采用双向电泳技术对弗氏2a志贺菌2457T株表达的全部碱性菌体蛋白及碱性膜蛋白进行分离,再通过基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱进行鉴定。结果:共鉴定到46个蛋白点,对应于38种蛋白质。结论:首次完成了弗氏2a志贺菌2457T株的碱性蛋白质组图谱。     

弗氏志贺菌毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655

目的:将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒pSF导入大肠杆菌MG1655。方法:通过诱动转移技术,将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655。结果:构建了MG1655/pSF:pXL275-virG的毒力大质粒导入突变株,双向电泳初步比较分析表明在重组MG1655中有志贺菌毒力的表达。结论:成功地将弗氏2a志贺菌2457T毒力大质粒pSF导入了大肠杆菌MG1655。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

肠道细菌弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌对斑翅果蝇生长发育和物质代谢的影响

【目的】明确弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundi和产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca两种肠道共生细菌对斑翅果蝇Drosophila suzukii生长发育和物质代谢的影响。【方法】以正常饲养条件下的斑翅果蝇、构建的斑翅果蝇无菌品系以及弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌单一共生菌感染的斑翅果蝇品系为材料,检测不同品系间斑翅果蝇的卵孵化率、3龄幼虫体重和化蛹率;测定不同斑翅果蝇品系3龄幼虫体内蛋白质、氨基酸、糖原和游离脂肪酸等代谢物的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活力。【结果】正常饲养条件下的斑翅果蝇卵孵化率、3龄幼虫体重、化蛹率及3龄幼虫体内蛋白质的含量均高于其他斑翅果蝇品系,且无菌品系中的最低。弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系3龄幼虫中的氨基酸和糖原含量均低于斑翅果蝇无菌品系和正常品系。弗氏柠檬酸杆菌感染斑翅果蝇品系3龄幼虫体内游离脂肪酸的含量较其他品系的也降到最低。弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌感染斑翅果蝇品系3龄幼虫体内POD活力显著高于无菌品系和正常品系,而CAT活力显著低于无菌品系。【结论】斑翅果蝇肠道中无肠道共生细菌时生长发育迟缓,在食物中分别添加弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌后可一定程度上促进斑翅果蝇的发育,这与添加肠道共生菌后斑翅果蝇体内代谢物的变化密切相关。     

虹鳟弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与多位点序列分型

本研究旨在对虹鳟体内分离菌进行分子鉴定分型及耐药性分析。通过形态学观察、生理生化反应、16S rRNA基因比对进化分析及管家基因多位点序列分型等方法,确定分离菌的种属地位、分析种内分子变异特征;利用纸片扩散法与PCR方法,分析分离菌耐药表型与基因型之间关系;进行人工感染小鼠试验,评估分离菌致病力强弱。结果显示,分离菌(GZBJ2017)为革兰氏阴性杆菌;16S rRNA基因与弗氏柠檬酸杆菌16S r RNA基因同源性达95.4%,结合生理生化反应结果,确定分离菌为弗氏柠檬酸杆菌;分离菌7个管家基因均发生变异,多位点序列分型鉴定为新序列型,与标准菌株ST-132亲缘关系最近;分离菌对头孢曲松、多粘菌素B、环丙沙星、氧氟沙星4种药物敏感,对四环素、庆大霉素、泰乐菌素、复方新诺明、青霉素、卡那霉素6种药物耐药;分离菌携带Sul1、Sul2、Intl1等3种耐药基因,与耐药表型相符;人工感染试验结果显示,该菌对小鼠具有一定的致病力。本研究对本次虹鳟发病的病因作出了准确诊断,为虹鳟弗氏柠檬酸杆菌感染的防治与分子流行病学研究提供依据。     

弗氏志贺菌磷酸化蛋白的检测

目的:检测弗氏志贺菌全菌蛋白中被磷酸化修饰的蛋白。方法:制取弗氏2a志贺菌2457T野生株全菌磷酸化蛋白样品时加入磷酸化酶抑制剂,随后对样品进行双向电泳,以抗磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸抗体为免疫探针,通过Western印迹找到被磷酸化的蛋白,并进行胶内酶解及MALDI-TOF质谱分析。结果与结论:共检测到13个磷酸化蛋白,其中9个为代谢途径中的酶。     

与某些非豆科植物共生的弗兰克氏菌(Frankia sp.)的泡囊及其固氮作用

非豆科植物的共生固氮作用大多数是由弗兰克氏菌的侵染形成根瘤引起。其中泡囊是弗氏菌在根瘤内的固氮场所(Akkermans等1977,Tjepkema等1981)。我们采用光学及电子显微镜对泡囊进行了观察,并对根瘤不同部位的泡囊数量及其固氮活性与其它生理活性的关系进行了研究。     

细胞膜微结构域中胆固醇对小鼠巨噬细胞摄取土拉菌的作用

本文旨在探讨细胞膜微结构域中胆固醇在小鼠巨噬细胞摄取土拉弗朗西斯菌LVS株中的作用。用电穿孔法将穿梭质粒pFNLTP6 gro-gfp导入土拉弗朗西斯菌LVS株; 细胞胆固醇用菲律平Ⅲ染色, 结合单克隆抗体的小窝蛋白-1 用键合了Alexa 594 的羊抗鼠二抗显色; 用Z 轴电动聚焦的荧光显微镜分析土拉弗朗西斯菌LVS株感染; 用甲基-β-环糊精干扰富含脂质的胞膜, 损耗胆固醇, 以评估膜微结构域的损伤对土拉弗朗西斯菌入侵的影响, 菲律平Ⅲ用于检测胆固醇损耗的效果。结果显示, 细胞胆固醇在早期与摄取的土拉弗朗西斯菌疫苗株共定位, 膜微结构域相关成分小窝蛋白-1 与两者接触密; 土拉弗朗西斯菌入侵巨噬细胞需要胆固醇丰富的膜结构域。结果提示, 胆固醇丰富的膜微结构域和小窝蛋白-1 在土拉弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞过程中发挥重要作用。     

金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌(土拉菌)的方法,评价其灵敏度、特异性、重复性及其应用。方法:以小鼠抗土拉菌脂多糖单克隆抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜、兔抗土拉菌多克隆抗体作为检测抗体标记胶体金,通过金标银染技术放大检测信号,建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;以经荧光定量PCR定量的土拉弗朗西斯菌为检测对象,比较金标银染免疫渗滤法和免疫层析法。结果:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌的最小检出量为1.0×103 CFU/mL,灵敏度高于免疫层析法;检测大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁菌和鼠疫耶尔森菌的结果均为阴性;密封保存的检测卡80 d内重复性良好,100 d后反应强度略有降低。结论:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要仪器设备,可作为快速检测土拉弗朗西斯菌的首选方法。     

弗氏志贺菌4c和2a型菌株的脉冲场凝胶电泳分型特征

目的：了解北京部分地区弗氏志贺菌4c型（F4c）和2a型（F2a）菌株的分子分型特征。方法：对2005年和2006年自北京部分地区腹泻监测分离的弗氏志贺菌菌株（4c型10株,2a型20株）进行生化鉴定和血清分型,用PCR检测侵袭性抗原基因ipaH,用改良Kirby-Bauer纸片法检测菌株的耐药谱,用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型。结果：10株血清型鉴定为F4c的菌株中,有7株间的PFGE图谱存在相当的差异,Dice系数为0.78～0.92,而F2a菌株与大部分F4c菌株间的距离较远（Dice系数小于0.8）;F4c和F2a菌株对14种抗生素的耐药谱略呈差异。结论：采用PFGE能够很好地辨别弗氏志贺菌4c型和2a型菌株;弗氏志贺菌4c型菌株具有易变性,可在流行过程中产生PFGE图谱的差异、血清亚型的转换、耐药谱的变化等。     

密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为指示菌,检测弗氏志贺菌(Shigella flexneri)密度感应系统信号分子AI-2,证明其可以分泌有活性的AI-2;其次,采用Golden Gate克隆法将大肠杆菌MG1655的密度感应系统基因克隆至弗氏志贺菌301中,获得密度感应系统回复株301。通过菌落计数表明,在混合培养条件下,密度感应系统基因回复株301比野生株301存在生长优势;通过双向电泳初步比较分析表明,密度感应系统基因可以在志贺菌中表达,并鉴定到了其他一些与应激反应相关的差异表达蛋白, 如Hsp60、GroEL、SodB。     

嗜热放线菌类群分类的研究IV．诺卡氏菌科嗜热种的研究

从亚热带地区土壤中分离出属于诺卡氏菌科的一些嗜热菌种,经52℃培养,通过形态、培养特征、生理生化特性及细胞壁组份等的研究,证明有与诺卡氏菌科菌种共同的特征,区别于这类菌的特性是嗜热性。本文报道属于3个属的4个新种：热黄色诺卡氏菌、Nocardia the-rmoflava n. sp.、热紫色诺卡氏菌 Nocardia thermoviolacea n. sp.、热酒红放线多孢菌Actinopolyspora thermovinacea n. sp.、热丁香类诺卡氏菌 Nocardioides thermolilacinus n. sp.。     

患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

【目的】确定导致大鲵(Andrias davidianus)细菌性感染死亡的病原。【方法】从大鲵肝脏中分离细菌,通过Biolog微生物自动鉴定系统及分子生物学方法对纯培养的细菌进行鉴定,再用大鲵和鲫鱼分别进行人工感染试验,以确定分离菌的致病性,同时对分离到的病原菌进行药物敏感试验。【结果】从患病大鲵肝脏中分离到一株致病菌JZ01,经人工感染健康大鲵,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的病原菌。该致病菌对健康鲫鱼也有致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明,该菌株对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。【结论】弗氏柠檬酸杆菌是大鲵的一种致病菌。本文在国内外首次报道了该菌对大鲵具有致病性。     

土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

目的建立胶体金免疫层析技术快速定量检测土拉弗朗西斯菌。方法利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立土拉弗朗西斯菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合检测曲线进行定量检测。在面粉、饼干、果冻、梨汁等食品样品中添加土拉弗朗西斯菌的FopA蛋白模拟污染样品,评价该方法对固体、半固体、液体等食品样品的检测能力。结果该法可在10min内完成定性和定量检测,灵敏度为750ng／ml,线性范围750～24000ng/ml、回收率为56．7％-89．2％。结论所建立的检测土拉弗朗西斯菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌,适用于现场快速检测。