肠道病毒71型(EV-A71)感染ICR小鼠模型的建立

为研究肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)经不同攻毒方式感染不同日龄ICR乳鼠的感染情况,了解EV-A71在小鼠体内的动态分布和感染机制,为建立EV-A71感染动物模型,本研究采用分离自重症手足口患儿的EV-A71毒株,分别通过肌肉注射(Intramuscular injection,IM)、腹腔注射(Intraperitoneal injection,IP)以及脑内注射(Intracerebral injection,IC)的方式感染3日、5日和9日龄ICR乳鼠,感染后定期采集血液和各组织,通过Realtime PCR追踪各组织中病毒载量变化,并且通过切片制作和免疫组化对感染乳鼠进行病原学和病理学分析。结果显示:对于低日龄(≤5日龄)乳鼠,注射剂量在104.5 TCID50/g·体重时IM、IP及IC均为较好的感染方式,都会出现神经症状,且有极高的致死率。随着日龄增长,感染后症状有所减轻,但IM和IP感染途径对大日龄乳鼠仍具有良好的致病性,且IM和IP死亡率显著高于IC死亡率。经IM、IP和IC注射感染病毒的3日龄乳鼠在6dpi体重相对于各对照组分别下降了1.54g(31.43%)、1.31g(15.06%)和2.52g(44.28%),而经IM和IP感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于各对照组分别下降了0.605g(8.95%)、0.886g(15.51%),经IC感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于对照组上升了0.904g(14.70%),感染组体重均显著低于对应的同期对照组(P0.05)。经IM、IP和IC感染病毒的3日龄乳鼠9dpi均死亡,而5日龄乳鼠9dpi存活率分别为42.8%、25%和87.5,14dpi存活率分别为0%、0%和25%,9日龄乳鼠9dpi存活率分别为70%、84.62%和100%。病理学及免疫组化检查显示EV-A71病毒具有强烈的嗜神经性及嗜骨骼肌的特性,可导致病毒血症、脑神经元及骨骼肌坏死、心肌间质水肿及多脏器炎症反应。我们系统地研究了不同攻毒方式感染不同日龄的ICR乳鼠后的病毒动态分布及免疫病理损伤,发现经肌肉注射或腹腔注射5日龄乳鼠能够建立理想的EV-A71感染动物模型。     

柯萨奇病毒A组6型对利巴韦林耐药性的初步研究

柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6,CVA6）已成为近年来国内导致手足口病的主要病原体。本研究挑选16株中国流行的不同基因亚型的CVA6，通过在RD细胞上的细胞活性实验和观察致细胞病变效应来检测利巴韦林对不同CVA6毒株的抑制率。结果表明药物浓度在0.8mmol/L和0.4mmol/L作用下对部分CVA6有明显的抑制作用（P<0.0001），在0.8mmol/L药物浓度下根据抑制率的高低，将抑制率大于80%的CVA6株（5株，占31.25%）以及低于10%的CVA6株（5株，占31.25%）分别定义为对利巴韦林敏感组和耐药组。为了探究CVA6耐药性与病毒致病力之间的关系，在利巴韦林敏感组与利巴韦林耐药组分别随机挑选两株CVA6进行ICR乳鼠感染实验。通过观察乳鼠生存率、临床评分和体重变化，结果显示利巴韦林耐药组CVA6致病力均比利巴韦林敏感组弱，表明利巴韦林耐药与致病力之间存在一定联系。最后使用MEGA软件对利巴韦林敏感组和耐药组CVA6进行3D区氨基酸序列比对分析，发现两组CVA6在3D区75位、308位、342位、346位氨基酸完全不同，提示利巴韦林耐药与...     

雷公藤甲素对病毒性心肌炎细胞凋亡及Fas/FasL 蛋白表达的研究

目的:研究雷公藤甲素对柯萨奇病毒B3病毒(CVB3)感染的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和Fas/FasL蛋白表达的抑制作用,探讨TP治疗病毒性心肌炎的作用机制。方法:将Balb/c小鼠随机分成4组作为动物模型,分别为对照组、模型组、利巴韦林组和TP组。对照组腹腔注射生理盐水,其余三组腹腔注射CVB3,利巴韦林组和TP组小鼠分别予以相应的药物治疗后,测定各组小鼠存活率及心肌病变积分,采用末端转移酶标记技术(TUNEL法)检测小鼠心肌细胞凋亡,免疫组化法检测Fas/FasL蛋白阳性表达。结果:空白对照组心肌无病变,利巴韦林组、TP组与模型组相比有显著性差异(P<0.01)。正常组鲜见心肌细胞凋亡,模型组细胞凋亡率较正常组显著增加(P<0.01),治疗组利巴韦林组和TP组凋亡率比模型组明显降低(P<0.05,P<0.01)。模型组Fas/FasL表达比正常组显著增多(P<0.01),治疗组利巴韦林组和TP组较模型组显著降低(P<0.01)。结论:雷公藤甲素具有通过抑制Fas/FasL蛋白的表达,减缓心肌细胞凋亡,达到抑制病毒性心肌炎从而保护心肌细胞的作用。     

CV-A16感染沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化分析

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是导致手足口病的病原体之一,CV-A16感染后宿主的外周血细胞的细胞因子表达变化的报道较少,也未见有关血清中细胞因子含量在感染前后的表达变化。为了分析CV-A16感染的不同严重程度的沙鼠细胞因子和趋化因子的动态变化。通过腹腔注射CV-A16构建CV-A16感染发病模型,应用流式细胞术、实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测病毒载量、血清炎症因子和趋化因子水平动态变化。CV-A16感染后重症沙鼠的临床症状,包括体重下降程度、临床症状分值以及死亡率均显著高于轻症沙鼠,并且重症沙鼠外周血白细胞比例和升高趋势总体上高于轻症感染沙鼠;重症感染沙鼠全血中细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA转录水平上调,IL-4、IL-10、IL-8和IP-10的mRNA转录水平下调;并且CV-A16感染后重症沙鼠血清中的TNF-α和IFN-γ含量显著上升,IL-8和IP-10的含量显著下降。结论为重症沙鼠全血和血清中存在多种趋化和炎症因子上调,可能与Th1炎症失调有关。     

EV71感染BABL/c乳鼠模型构建

目的 构建中重症EV71型手足口病的BABL/c乳鼠模型。方法 1日龄BALB/c乳鼠连续3 d腹腔注射EV71病毒液，监测小鼠体质量、生存率和临床疾病评分；采用HE染色检测脑、肺和骨骼肌组织病理变化；光镜下观察感染乳鼠脑、肺和骨骼肌组织匀浆作用RD细胞的细胞病变反应；采用蛋白质免疫印迹和免疫荧光法检测VP1和3D蛋白水平。结果 与正常对照组相比，EV71感染乳鼠体质量从第3天开始下降，2组比较差异有统计学意义（t=8.421 0,P<0.05）；生存率随感染时间延长逐渐下降；疾病评分显著增加；脑、肺及骨骼肌组织中VP1和3D蛋白表达与正常对照组比较显著升高（脑组织：t=6.355 7、3.423 2，肺组织：t=14.864 8、4.469 0，骨骼肌：t=7.908 5、4.923 7，均P<0.01）。结论 成功构建了中重症EV71型手足口病BALB/c乳鼠模型。     

流行性出血热病毒对乳鼠致病特点的观察

本文观察了两株从病人体内新分离的流行性出血热(EHF)病毒114株和435株对乳鼠的致病特点,并在感染的乳鼠脑内找到了EHF病毒。免疫荧光检查发现,病毒抗原广泛存在于感染鼠的脑、肺、肝、肾等脏器。脑内和腹腔两条感染途径的比较发现,病毒抗原在上述脏器中的分布基本一致,但前者脑内的病毒感染滴度较后者高一个对数单位。对病毒的动态观察发现,EHF病毒首先在乳鼠腹腔感染6小时后的腹腔巨噬细胞(Mφ)中分离到、并持续阳性;病毒血症出现在感染后2天,随之在脑、肺、肝、肾和脾脏中查到。以上结果表明:EHF病毒对乳鼠具有广泛的嗜性,脑内感染途径能获得较高滴度的感染性病毒。提示EHF病毒在鼠mφ中增殖并携带至全身播散,可能是造成乳鼠全身性弥漫性感染的主要原因。     

α干扰素和利巴韦林抗丙型肝炎病毒作用的比较研究

α干扰素(IFN-α)联合利巴韦林是目前临床治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的标准方案.本研究以体外培养的感染性病毒HCVcc为研究对象,比较IFN-α和利巴韦林对HCV复制的影响,以及对干扰素调节因子9(IRF9)和干扰素刺激基因15(ISG15)等抗病毒基因的调节能力.结果显示,100 u/ml IFN-α显著降低HCV RNA水平,利巴韦林剂量依赖性抑制HCV复制,且IFN-α联合利巴韦林对HCV复制及HCV NS3和E2蛋白表达具有协同抑制作用.5～80 u/ml IFN-α剂量依赖性诱生IRF9和ISG15;1和5μg/ml利巴韦林不促进IRF9和ISG15水平升高;而利巴韦林联合IFN-α对两者亦无促进作用.     

分析阿奇霉素联合利巴韦林治疗小儿支原体肺炎的疗效

目的:观测阿奇霉素联合利巴韦林治疗小儿支原体肺炎的临床疗效.方法:治疗组90例,予以阿奇霉素和利巴韦林治疗;对照组90例,予以阿奇霉素治疗.结果:治疗组和对照组总有效率分别为为97.78%和86.66%,两组总有效率比较差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:小儿支原体肺炎多合并病毒双重感染,阿奇霉素联合利巴韦林治疗效果显著,病程短,值得临床推广.     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具。方法用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株。以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定。结果与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1d和5d达到高峰。EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化。免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布。结论阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价。     

芪红胶囊通过免疫调节治疗病毒性心肌炎小鼠

目的观察芪红胶囊是否通过调节病毒性心肌炎小鼠的免疫系统发挥抗病毒作用。方法实验选用纯系雄性BALB/c小鼠,分组为：正常对照组、假处理对照组、利巴韦林对照组、芪红胶囊高、中、低剂量组,每组均为20只小鼠,腹腔注射10-3TCID50CVB3病毒造成病毒性心肌炎模型,4 h后灌胃给予芪红胶囊进行治疗,以利巴韦林作为阳性对照药物,于第3、6、9、12、15天随机选择每组中的4只动物进行实验。应用SABA18生化分析仪检测小鼠血清中LDH和CK-MB含量;通过芪红胶囊抑制VSV病毒在L929细胞上的毒力,测定芪红胶囊刺激脾细胞产生干扰素的效价;应用固定病毒稀释血清法测定血清中中和抗体浓度,最后取出小鼠心脏,制备心肌组织悬液,检测不同分组心脏组织中CVB病毒滴度。结果芪红胶囊能够显著降低血清中CK-MB和LDH含量（P〈0.05）,显示心脏受损程度减轻,并呈现量效关系;芪红胶囊具有诱生干扰素的能力,与病毒对照组间存在显著的统计学差异（P〈0.05）,利巴韦林组刺激干扰素产生的能力非常明显,优于芪红胶囊。此外,芪红胶囊具有刺激机体产生中和抗体的能力。对各组小鼠心肌组织悬液进行病毒滴度测定,发现病毒对照组小鼠的血清中,从第3天开始病毒滴度逐步上升,芪红胶囊药效组能够明显降低血清中的病毒滴度,在5个不同的时期均与病毒对照组存在显著的统计学差异（P〈0.05）,利巴韦林组也有明显的降低病毒滴度的作用（P〈0.05）。结论芪红胶囊能够减少CVB病毒在心肌组织中的繁殖,其机制与芪红胶囊对小鼠免疫系统的调节有关。