重组人TACE的解整合素域对人肺腺癌A549体外增殖、粘附和侵袭的抑制作用

为了解人TACE的解整合素域对肿瘤细胞粘附和侵袭的影响以及其独立于其他结构域发挥作用的能力,从单核细胞系THP1中提取RNA,RT-PCR扩增出TACE全长基因,构建了pMD18T-TACE载体。对pMD18T-TACE质粒进行PCR,分别扩增T300(300bp,编码解整合素域)、T800(800bp,编码酶催化域)及T1300(1300bp,编码胞外域)三个片段,将其分别亚克隆至表达载体pET28a( )。把质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物均以不溶性包涵体形式存在。经过溶解包涵体、BBSTNTA树脂柱亲和层析并透析复性,获得高纯度的三种活性蛋白。MTT法、细胞粘附实验、Transwell小室侵袭实验分别显示TACE解整合素域、胞外域蛋白均能明显抑制A549细胞的增殖,且以剂量依赖性的方式抑制A549细胞与纤维粘连蛋白的粘附,并能抑制Transwell小室中A549细胞对Matrigel模拟的天然基底膜的侵袭,而酶催化域蛋白则无相应的抑制能力。表明重组TACE解整合素域蛋白可独立抑制肿瘤细胞的增殖、粘附和侵袭,为深入研究该区域的作用及TACE在肿瘤发病中的机制提供了新的认识。     

整合素β2促进人乳腺癌细胞MCF-7的迁移,侵袭与粘附

本研究主要目标为探讨整合素β2 (ITGB2)的高表达对人乳腺癌细胞MCF-7迁移,侵袭与粘附能力的影响。本研究首先构建了ITGB2过表达质粒,实验设阴性对照组(pcDNA-3.1+)与ITGB2基因过表达组(pcDNA-3.1+/ITGB2)。ITGB2过表达质粒转染MCF-7细胞后,采用逆转录PCR与Western blotting方法分别检测ITGB2 mRNA转录水平与蛋白翻译水平;流式细胞术检测细胞周期的改变;划痕实验检测细胞横向迁移能力;Transwell小室实验检测细胞纵向迁移能力及侵袭能力;人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)粘附实验检测癌症细胞与血管内皮细胞之间的粘附能力,Western blotting实验检测侵袭相关指标MMP9,整合素经典通路中FAK蛋白磷酸化水平的改变。研究结果表明:转染ITGB2过表达质粒后,MCF-7细胞中ITGB2的m RNA水平(p<0.01)与蛋白水平(p<0.05)均显著增高;流式细胞术实验中,实验组S期的细胞所占比例与对照组无明显差异;划痕实验与Transwell小室实验中,实验组的迁移侵袭能力显著性增强;人脐静脉血管内皮细胞粘附实验中,实验组乳腺癌细胞与血管内皮细胞的粘附能力强于对照组(p<0.05);且Western blotting结果显示MMP9和p-FAK蛋白水平明显上升。由以上结果可得出结论,过表达ITGB2后会增强人乳腺癌细胞MCF-7的迁移、侵袭与粘附能力,而对其增殖能力无明显影响。     

过表达Snail增强肺癌细胞A549的体外侵袭能力

用锌指转录因子Snail诱导肺癌细胞A549发生上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),检测肺癌发生EMT后细胞侵袭能力的变化,为临床筛选分子靶向药物提供依据.构建pcDNA3.1-snail载体,用pcDNA3.1-snail及空pcDNA3.1载体转染肺癌A549细胞后,进行G418筛选;光镜观察培养后细胞形态学的改变、免疫细胞化学与免疫荧光检测细胞表达E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的改变,Western印迹检测细胞中E-钙黏着蛋白和波形蛋白的改变,Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测.采用pcDNA3.1-snail转染细胞后,A549细胞变得细长,细胞融合度降低.免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹结果显示,E-钙黏着蛋白表达降低,波形蛋白表达升高;transwell侵袭小室法结果显示,过表达Snail的A549细胞穿透matrigel胶的细胞数明显增多.结果提示,Snail能有效诱导肺癌发生EMT,并且能增强肺癌的体外侵袭能力.     

蛋白酪氨酸激酶抑制剂Genistein抑制肺癌细胞A549体外侵袭作用的研究

观察蛋白酪氨酸激酶抑制剂Genistein对人肺腺癌细胞株A549细胞侵袭能力的影响,探讨Genistein抑制肺癌细胞侵袭的可能机制。以不同浓度Genistein（20μmol/L和40μmol/L）作用于A549细胞3 d后,分别用基质胶侵袭模型、黏附基质分析、Transwell小室趋化运动模型、细胞骨架蛋白染色及RT-PCR法来研究药物处理后细胞侵袭、黏附、运动、聚合型骨架蛋白（F-actin）以及基质金属蛋白酶基因表达的改变。经Genistein处理后,A549细胞的F-actin聚合减少,侵袭能力明显下降,趋化运动能力降低,基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）基因相对表达量增加,但黏附率没有降低。Genistein可降低肺癌细胞的迁移、侵袭能力。F-actin聚合减少,TIMP-1的相对表达量增加,可能是Genistein抑制肺癌细胞侵袭的机制之一。     

基于PTEN-PI3K-AKT信号通路探讨竹节参总皂苷抑制人肺腺癌A549细胞增殖和转移的机制

目的:竹节参是人参属植物,和人参成分相似,前期研究其对肺癌具有一定的抑制作用,但作用机制不清,因此,本项目拟研究竹节参皂苷对人肺癌细胞系A549增殖、迁移和侵袭能力以及PTEN-PI3K-AKT信号通路的影响。方法:CCK8法测定不同浓度和不同作用时间的竹节参皂苷对A549存活率的影响,划痕实验测定细胞迁移能力,Transwell小室测定细胞的侵袭能力,ELISA试剂盒测定培养基上清中MMP-2和MMP-9水平的变化。Western blot测定PTEN、P-PI3K和P-Akt表达的变化。结果:竹节参皂苷对A549细胞增殖具有明显的抑制作用,呈浓度和时间依赖关系,与对照组比较具有统计学差异。同时,竹节参皂苷可以浓度依赖性的抑制细胞侵袭和转移,以及MMP-2和MMP-9细胞因子的分泌。Western blot结果表明竹节参皂苷可促进PTEN蛋白表达,抑制P-PI3K和P-Akt蛋白表达,采用PTEN的特异性抑制剂SF1670证实竹节参皂苷通过抑制PTEN发挥作用。结论:竹节参皂苷可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭,以及分泌蛋白MMP-2和MMP-9表达,其作用机制可能是通过调控PTEN抑制PI3K和Akt磷酸化,从而发挥抗癌作用。     

姜黄素对A549肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用及与Keap1/Nrf2信号通路的关系

目的探究姜黄素对肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用及其机制。方法通过MTT法检测姜黄素对A549细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术测定姜黄素对A549细胞凋亡的调节作用;通过Transwell试验,观察姜黄素对肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot实验和RT-PCR实验,观察姜黄素对其Keap1/Nrf2信号通路的调节作用。结果增殖实验、凋亡实验和Transwell实验显示,姜黄素能够显著性抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并能够促进其凋亡。Western blot检测显示姜黄素能够显著抑制Keap1和Nrf2表达;RT-PCR实验结果显示姜黄素能够显著抑制Keap1mRNA和Nrf2 mRNA表达。结论姜黄素可能通过抑制Keap1/Nrf2信号通路蛋白的表达而抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡。     

miRNA-132抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力

目的观察miRNA-132在不同骨肉瘤细胞系中的表达及对骨肉瘤细胞生物学行为的影响,探讨miRNA-132在人骨肉瘤发生发展中的作用。方法通过荧光定量PCR技术检测不同骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中miRNA-132的表达情况,使用pRFP-miRNA-132-down质粒转染U2OS细胞、pRFP-miRNA-132-up质粒转染143B细胞,使用EdU检测肿瘤细胞增殖状态,Transwell小室检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力。结果在3种骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中,miRNA-132的表达依次下降(U2OSMG63143B);降低miRNA-132在U2OS细胞中的表达促进细胞的增殖和侵袭能力,增加miRNA-132在143B细胞中的表达抑制细胞的增殖和侵袭能力。结论 miRNA-132可能通过抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭调节骨肉瘤的发生发展。     

bFGF 诱导肺腺癌细胞系A549 上皮间质转化

目的:探讨上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺癌侵袭转移中的作用。方法:体外培养A549细胞,以bFGF(10ng/ml)进行干预后,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;间接免疫荧光观察上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物vimentin蛋白表达的变化;采用细胞划痕试验检测bFGF对A549细胞迁移能力的影响;采用transwell小室试验检测bFGF对A549细胞侵袭能力的影响。结果:bFGF(10ng/ml)干预后,在倒置相差显微镜下观察,A549细胞形态变成了梭形,形态如同成纤维细胞。间接免疫荧光显示A549细胞E-cadherin表达随时间延长逐渐减弱,而vimentin表达逐渐增强。细胞划痕试验显示,bFGF干预后细胞迁移能力提高。Transwell小室试验显示,bFGF干预后细胞侵袭能力提高。结论:bFGF在体外诱导肺腺癌细胞系A549细胞发生上皮间质转化,上皮间质转化是肺癌侵袭转移的重要机制之一。     

沉默BCAT1对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的:研究BCAT1在肺癌细胞A549的增殖、迁移及侵袭能力中的作用。方法:通过小干扰RNA(si RNA)沉默A549细胞中BCAT1的表达,细胞分为对照组(Con)、BCAT1基因沉默组(si RNA-BCAT1)和si RNA阴性对照组(si RNA-NC)。利用Western blot检测si RNA对BCAT1的沉默效果;划痕愈合实验检测沉默BCAT1后A549细胞迁移能力的改变;Transwell小室侵袭实验检测沉默BCAT1后A549细胞侵袭能力的变化;MTT实验检测沉默BCAT1对A549细胞增殖能力的影响。结果:与Con组相比,si RNA-BCAT1组的BCAT1蛋白表达明显降低(P0.05),细胞划痕愈合率明显降低(P0.05),能够穿膜的细胞数明显减少(P0.05),而Con组和si RNA-BCAT1组细胞的增殖能力比较差异无明显统计学意义(P0.05)。结论:沉默BCAT1抑制A549细胞的迁移和侵袭能力,而对其增殖能力无影响。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的:构建人DC-SIGN基因真核表达质粒,观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达.为进一步研究DC-SIGN的作用奠定实验基础.方法:用PCR的方法扩增编码DC-SIGN的基因序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA中,酶切及测序鉴定重组质粒.将构建的重组质粒转染到A549细胞中,用Western Blotting和免疫荧光等方法检测DC-SIGN基因的表达.结果: 从人cDNA文库中得到1 215bp的DC-SIGN序列后,重组到pCDNA载体中,经酶切及测序鉴定,成功构建pCDNA-DC-SIGN重组质粒.重组质粒转染A549细胞,经Western blotting检测,发现在约55kDa处有特异条带,与理论大小相符.应用免疫荧光技术检测DC-SIGN可在A549细胞内的表达.荧光显示Myf5蛋白定位在细胞浆中.建立表达DC-SIGN的细胞株.结论:成功构建了人DC-SIGN的真核表达载体,并建立了人DC-SIGN的真核表达细胞株.     

钙信号转导途径介导肺炎链球菌侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞

用Factin 特异性FITCphalloidin荧光染料,观察肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）作用A549细胞前后的Factin细胞骨架重排情况;用细胞松弛素D预处理A49细胞,观察肺炎链球菌对A549细胞的侵袭率;使用Datrolene预处理A549细胞,观察其与Factin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系;用Fura2/AM荧光探针负载A549细胞后测定肺炎链球菌粘附A549细胞后的胞内Ca2+浓度。结果发现肺炎链球菌作用A549细胞后,Factin细胞骨架呈块状、丝状聚集;而松弛素D可明显降低肺炎链球菌对A549细胞的侵袭率;肺炎链球菌粘附A549细胞后胞内Ca2+高于对照;Datrolene可部分抑制A549细胞Factin细胞骨架重排,且与Factin细胞骨架重排百分率间存在量效关系。以上结果提示肺炎链球菌可通过Ca2+细胞信号转导途径触发A549细胞Factin细胞骨架重排,进而导致肺炎链球菌侵袭A549细胞。     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

重组蛋白rLj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制研究

该文研究了重组蛋白r Lj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制。采用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测r Lj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,采用Transwell方法检测r Lj-112对A549细胞迁移和侵袭的影响,Hoechst和吉姆萨染色的方法检测r Lj-112对A549细胞凋亡的影响;采用Western blot法检测r Lj-112对A549细胞信号通路相关蛋白质水平的影响。结果表明,r Lj-112能够抑制A549细胞的增殖,半抑制浓度IC50值为1.64μmol/L;r Lj-112能抑制A549细胞的迁移和侵袭并呈剂量依赖性;r Lj-112能诱导A549细胞的凋亡;r Lj-112处理过的细胞cleaved-caspase3蛋白质和cleaved-PARP蛋白质水平升高,证明r Lj-112通过caspase3/PARP途径执行对A549细胞的凋亡的诱导,p-AKT、p-PI3K和p-Erk1/2的水平下降,提示r Lj-112的作用方式与PI3K/AKT相关信号通路有关。     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p0.01,p0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p0.01),间质标志蛋白Vimentin(p0.05)、N-cadherin(p0.01)和Fibronectin(p0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p0.05,p0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。     

一种特异性识别非小细胞肺癌A549细胞的小分子肽

应用"一个珠子一个化合物"的组合化学肽库,以期筛选得到特异性识别非小细胞肺癌细胞(A549)的小分子肽.初次筛选共得到29个与A549阳性结合的珠子,经氨基酸序列分析后发现含有-NGXG-肽链结构的序列共有10个.选择cNGQGEQc作进一步的细胞特异性研究,发现cNGQGEQc与非小细胞肺癌A549、Calu-1及H178的粘附特异性明显高于其他细胞系,对cNGQGEQc的结构分析显示,-NGXG-及六肽长度对小分子肽与A549细胞的粘附非常重要.标记FITC的小分子肽cNGQGEQc能与A549细胞发生特异性结合.用抗整合素的抗体(!1～6,"v和#1～5)阻断小分子肽与A549细胞表面的相应受体结合,结果显示,α3与$亚单位的任何组合均对cNGQGEQc与A549细胞的粘附有明显的阻断作用.结果表明,小分子肽cNGQGEQc是通过细胞表面整合素α3与非小细胞肺癌A549发生特异性结合.     

Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究

目的:探讨核蛋白1(Nupr1)调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究。方法:肿瘤抑制剂盐酸素(salinomycin)不同时间处理非小细胞肺癌细胞A549后采用Western Blot法检测非小细胞肺癌细胞A549中Cleaved Caspase-3、Nupr1的蛋白表达;Transwell小室检测Nupr1基因沉默后非小细胞肺癌细胞A549细胞体外迁移、侵袭能力的变化;Western Blot法检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549 MMP-2、TIMP-1的蛋白表达;流式细胞仪检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549的凋亡情况。结果:与未经肿瘤抑制剂salinomycin处理对照组相比较,salinomycin处理后的非小细胞肺癌细胞A549中Nupr1蛋白表达量下降,Cleaved Caspase-3蛋白表达量升高,并且随着作用时间呈依赖关系。Nupr1-siRNA转染组的迁移能力相比对照组未转染组下降(64.4±7.2)%,Nupr1-siRNA转染组的侵袭能力相比对照组下降(58.7±7.3)%。与未转染Nupr1-siRNA对照组相比较,转染后TIMP-1的表达明显上调,而MMP-2的表达则明显下调。流式细胞仪检测结果显示Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549出现大量凋亡。结论:Nupr1基因沉默后通过上调TIMP-1的表达,下调MMP-2的表达降低肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力,进而促进非小细胞肺癌细胞凋亡。     

奥沙利铂对子宫内膜癌HEC-1A侵袭转移的影响

目的研究奥沙利铂对人子宫内膜癌细胞HEC-1A侵袭转移的影响。方法体外稳定培养HEC-1A细胞株系,用不同浓度奥沙利铂(40、80、160μg/ml)给药72h后,采用Transwell法测定奥沙利铂对HEC-1A侵袭能力的影响,重组基底膜试验测定奥沙利铂对HEC-1A粘附能力的影响,划痕试验检测奥沙利铂对HEC-1A迁移能力的影响。结果与未处理对照组比较,奥沙利铂(40、80、160μg/ml)明显抑制HEC-1A侵袭性,提高侵袭抑制率(P0.01),显著降低肿瘤细胞的迁移能力(P0.01),降低HEC-1A粘附程度(P0.01)。结论奥沙利铂有效抑制子宫内膜癌细胞继发性侵袭及转移,从而发挥抗癌作用。     

糖基化磷脂酰肌醇锚定型EGFP真核表达质粒的构建及表达

构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)序列的真核表达质粒,并检测其在A549细胞中的表达.分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243 bp GPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pEGFP-C1质粒中,构建并鉴定pEGFP-C1-GPI质粒.经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况.经酶切和测序鉴定证实,所克隆的CD24 GPI序列正确,荧光显微镜观察pEGFP-C1-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pEGFP-C1质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光.成功构建与EGFP相连的GPI真核表达质粒,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚定表达型肿瘤疫苗奠定基础.