血友病AAV载体基因治疗研究进展

血友病基因治疗经过30年的持续发展,已取得长足的进步.血友病患者FⅧ或FⅨ水平达到正常甚至治愈已成为可能.虽然在多个国家血友病基因治疗已取得显著成果,但仍然有很大的改进空间.目前临床试验中AAV是血友病基因治疗的主要载体,未来的研究将集中在完善病毒衣壳、转基因和启动子的设计上,以追求更高的转导效率、更低的免疫反应和可预...     

血友病A的基因治疗研究进展

血友病A是由于编码凝血因子Ⅷ (简称FⅧ )的基因先天性异常而导致的机体出血紊乱性遗传病 ,基因治疗是彻底治愈血友病A的一种最为理想的治疗措施 .就FⅧ基因及其蛋白质分子的结构与性质、基因治疗载体构建、靶细胞、动物模型及其临床应用作一简要综述 .     

逆转录病毒载体在血友病A基因治疗中的研究进展

基因治疗是彻底治愈血友病A的最理想方法,逆转录病毒是最为常用的载体之一,本文对逆转录病毒在血友病A基因治疗中的研究进展作一综述。     

血友病A基因治疗载体研究现状

血友病A是X染色体隐性遗传出血性疾病。其发病原因是患者血液中先天缺乏凝血因子FⅧ。用于血友病A基因治疗研究的载体有病毒载体和非病毒载体,目前研究较多的是病毒载体,主要有逆转录病毒载体和慢病毒载体,腺病毒载体及腺相关病毒载体等。非病毒载体主要有质粒、脂质体、转座子等。文章拟对血友病A基因治疗各载体的特点和研究进展作一综述。     

皮肤成纤维细胞肌内注射表达外源基因的可行性

将分别带有报告基因lacZ和人凝血因子ⅨcDNA的兔原代皮肤成纤维细胞直接注射到兔肌肉组织后 ,皮肤成纤维细胞可以长期存活并持续表达外源基因 .其中β 半乳糖苷酶表达至少持续 3个月 ,人凝血因子Ⅸ蛋白表达持续 1个月 .研究结果将皮肤成纤维细胞的优点和肌肉组织途径的优势有机地结合起来 ,为血友病B及其他遗传病的体细胞基因治疗提供一条新的途径 .     

人凝血因子ⅨcDNA在C2C12成肌细胞及C3H小鼠中的高效表达

以小鼠C2C12成肌细胞为对象开展血友病B基因治疗研究.除已有的XLIX,LNCIX和GlNaCIX反转录病毒载体外,又首次将微小MCK(muscle creatinekinase)增强子顺序构建到hCMV(human cytomegalovirus)启动子上游,共同控制FIXcDAN的转录.用带有上述4种载体的病毒悬液分别感染C2C12细胞后,ELISA检测结果发现,FIX蛋白离体表达水平为:G1NaMCIX>GlNaCIX>LNCIX>XLIX.其中C2C12/G1NaMCIX混合克隆高达640ng/(10~6细胞·24h).C2C12/G1NaMCIX细胞注射C3H小鼠后肢骨骼肌肉组织,人FIX蛋白持续表达35d,其中最高表达峰达206ng/mL血浆.此结果对于研究FIX cDNA在脱细胞中的表达调控以及采用成肌细胞移植途径开展血友病B基因治疗研究有重要意义.     

通过启动子同源重组研究人凝血因子Ⅸ的组成型表达

为了探索定点整合基因治疗血友病B的可行性,开展了在HeLa细胞中的hFIX组成型表达研究.同源重组载体p921构建后,电穿孔转入细胞,经过GCV和G418克隆选择,通过特异性的PCR证实了同源重组的发生,hCMV启动子定点替换hFIX基因在非肝细胞中可以被启动子hCMV转录表达,显示人为进行基因表达调控的可行性.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

Baxter公司的基因疗法正形成规模

研究基因治疗的公司正像这门新兴科学的进步一样在迅速发展。而且,这种势头还不只限于这些公司,一些大制药公司也正以合作和合资方式参与这一事业。最新的加入者是Baxter Healthcare公司(Deerfield,IL),它的基因治疗单位已在93年8月正式成立。 新单位隶属于该公司生物技术集团,致力于对癌、血友病和糖尿病的基因治疗,这类病的治疗技术都有上10亿美元的市场。公司希望在明年晚些时候对癌和血友病A的治疗进行临床试验。美国有2万个A型血友病患者,日本和欧洲约有5万。由于遗传缺陷,这些人不能产生凝血蛋白因子Ⅷ而导致严重失血。该     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.