辣椒CaWRKY14转录因子的生物学特性研究

WRKY转录因子是植物响应病原菌胁迫最重要的转录因子之一,且参与抗病反应及信号传导通路的调控。为研究辣椒WRKY基因的生物学特征,以辣椒高抗疫病材料CM334为试材,克隆获得响应疫霉菌诱导的转录因子CaWRKY14。生物信息学分析表明,该基因DNA全长2 530 bp,cDNA全长1 662 bp,含有5个内含子,编码553个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域,属于Group Ⅱ(b)。实时荧光定量表达分析表明,CaWRKY14不仅受ABA和疫霉菌胁迫诱导表达,且表达量分别在12 h和24 h时达到峰值,分别是对照的8.54和8.04倍,同时也受高盐、热激和干旱胁迫诱导。利用VIGS技术对CaWRKY14转录因子进行沉默后发现,抗病材料CM334接种疫霉菌后趋于发病。研究表明,CaWRKY14基因在辣椒响应疫霉菌胁迫进程中可能发挥着重要作用。     

硅对辣椒CaWRKY41基因温度胁迫下表达分析

WRKY转录因子是植物界中存在的一类较大的基因家族,参与植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。为了研究在低温和高温等非生物胁迫对辣椒CaWRKY41基因表达的影响,以豫椒101为实验材料,在对辣椒CaWRKY41基因克隆的基础上,利用生物软件对其编码蛋白进行分析和构建进化树。结果表明,同源扩增获得的序列含有一个990 bp完整ORF框;对其编码蛋白分析发现,只含有一个WRKY结构域,属于WRKY41家族。亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明与茄属亲缘关系最近,相似性达到92%。荧光定量分析表明,与对照相比,低温、高温胁迫都能诱导CaWRKY41基因表达,表明CaWRKY41基因在应对低温和高温胁迫方面具有重要作用。     

辣椒CaNAC55基因克隆与表达分析

为揭示辣椒NAC转录因子的功能,以高抗疫病辣椒CM334为试验材料,克隆获得CaNAC55基因全长gDNA和cDNA序列。生物信息学分析表明,CaNAC55基因gDNA全长4 164 bp, cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 299 bp,基因编码的蛋白由432个氨基酸残基组成;基因序列比对和同源性分析结果表明,CaNAC55与辣椒(XM-016722474)、番茄(XM-004241285)和马铃薯(XM-006361027)的亲缘关系最近,氨基酸相似度分别达到99.87%、93.37%和92.62%。实时荧光定量分析表明,干旱、高盐、热激处理均可诱导CaNAC55基因表达,其中干旱、高盐、热激处理分别在24 h、24 h和12 h时表达量达到峰值,且分别为对照的3.01倍、20.92倍和8.84倍;ABA处理下,CaNAC55基因的相对表达量显著低于对照,说明CaNAC55基因的表达受到ABA的抑制。研究表明,辣椒CaNAC55转录因子对不同逆境胁迫的响应不同,推测辣椒CaNAC55基因可能作为重要的调节因子参与逆境胁迫响应。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

桑树MaPP2C8基因克隆及其干旱胁迫下的表达

该研究基于桑树转录组测序结果及基因组数据库,采用PCR技术,克隆获得桑树2C型蛋白磷酸酶基因MaPP2C8的cDNA及其启动子序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并采用qRT-PCR方法检测MaPP2C8在干旱胁迫处理下的表达特性,为进一步研究MaPP2C8基因在干旱胁迫响应中的功能奠定基础。结果显示:(1)MaPP2C8基因cDNA全长为1 309 bp,开放阅读框(ORF)全长为1 053 bp,编码350个氨基酸。(2)MaPP2C8蛋白与桑科其他植物亲缘关系较近,归属于PP2Cs家族中的A亚族。(3)MaPP2C8蛋白分布于细胞中的多个位置,包括细胞质、细胞核及细胞膜等。(4)克隆获得MaPP2C8基因编码起始位点上游长度为1 612 bp启动子序列,该启动子含有3类激素相关的顺式作用元件,且与ABA相关的元件多达3个。(5)MaPP2C8基因受干旱胁迫诱导上调表达,复水处理后,其表达量显著下调。研究表明,MaPP2C8基因在桑树响应干旱胁迫过程中可能起重要作用。     

‘云香’水仙NtWRKYY2基因的克隆及功能分析

以‘云香’水仙为材料,采用PCR技术分离中国水仙WRKY转录因子家族成员NtWRKYY2(GenBank登录号为KX056496),其开放阅读框(ORF)长度为867bp,编码289个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化树分析显示,NtWRKYY2编码蛋白含1个WRKY结构域和C2H2锌指结构(Csx4Cx23HxH),属于第Ⅱd类WRKY转录因子。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,NtWRKYY2在‘云香’水仙应对盐胁迫中显著上调表达。利用InFusion克隆技术成功构建过表达载体pMDC140-NtWRKYY2,并采用农杆菌介导叶盘法转化烟草,获得11株卡那霉素抗性植株,转化子进一步PCR检测结果显示,其中有8株目的基因已成功导入烟草基因组中,转化率为72%。盐胁迫处理和叶绿素荧光参数分析显示,盐胁迫处理后NtWRKYY2过表达的转基因烟草萎蔫和黄化程度小于野生型植株,Fv/Fm值下降幅度小于野生型植株。研究表明,NtWRKYY2过表达的转基因烟草具有抵抗盐胁迫的能力。该研究为水仙抗盐转基因育种提供备选目的基因。     

胡萝卜ABF转录因子基因DcABF1的克隆与非生物胁迫应答分析

ABF转录因子是一种碱性亮氨酸拉链类蛋白,与植物的生长发育和逆境调控密切相关。该研究以胡萝卜‘君川红’为材料,克隆出编码ABF转录因子的基因DcABF1,分析其编码氨基酸的序列组成、进化关系和蛋白质理化性质等;采用实时荧光定量PCR方法检测DcABF1基因在不同非生物胁迫下的应答模式。结果显示:DcABF1基因含有一个长1 293 bp开放阅读框,编码430个氨基酸,其蛋白质分子量为104.96 kD,理论等电点为4.85。对DcABF1蛋白与其他植物的ABF家族成员进行同源性比对与进化树分析表明,DcABF1与榴莲中的ABF亲缘关系最近。蛋白质功能域预测发现,DcABF1蛋白中有28.84%的α螺旋和56.05%的无规则卷曲。DcABF1基因启动子区域含有多个顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,DcABF1基因对高温、低温、盐胁迫均有响应,其表达水平在盐处理下均高于对照,且于处理后4 h达到峰值,呈先上升后下降的趋势,但干旱处理下DcABF1基因的表达水平与对照相比均下降。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

茶树CsGIF1基因的克隆及其对非生物胁迫的响应分析

GRF-INTERACTING FACTOR(GIF)基因是植物叶发育相关的一类重要调控因子,调节植物叶器官的发育。该研究采用RT-PCR方法从茶树‘龙井43’的叶片cDNA中克隆得到CsGIF1基因,并利用荧光定量PCR分析了高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L-1 PEG)、盐胁迫(200mmol·L-1 NaCl)下CsGIF1基因的表达水平,以明确CsGIF1基因对非生物胁迫的应答特性,为茶树CsGIF1基因的逆境调控以及功能研究奠定基础。结果表明:(1)CsGIF1基因长666bp,编码221个氨基酸,具有高度保守的SNH结构域;CsGIF1蛋白为亲水性蛋白,理论相对分子质量为23 380,理论等电点为6.30;酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸所占比例分别为7%、9%、5%和13%;蛋白质二级结构显示,茶树CsGIF1蛋白由38.01%的α-螺旋、10.41%的β-折叠、12.22%的延伸主链和39.37%的随机卷曲组成。(2)qRT-PCR分析显示,茶树CsGIF1基因对于4种非生物胁迫均有响应,但不同处理响应不同。其中在胁迫2h时,高温和低温胁迫下,CsGIF1基因相对表达量显著增加,分别为对照的3.54和5.69倍,且高低温胁迫下,CsGIF1基因响应明显大于干旱和盐胁迫。在高温、低温、干旱、盐等不同胁迫处理下,茶树‘龙井43’中CsGIF1基因的表达水平与对照相比均差异明显。     

中间锦鸡儿WRKY75基因对拟南芥耐受盐和ABA能力的影响

该研究从旱生灌木中间锦鸡儿中克隆得到1个CiWRKY75基因。序列分析显示,CiWRKY75开放阅读框长570bp,编码189个氨基酸,含有1个WRKYGQK基序和1个C2H2型锌指结构,属于第二类WRKY转录因子。亚细胞定位显示,CiWRKY75定位于细胞核。实时荧光定量PCR检测表明,CiWRKY75基因的表达受盐胁迫和ABA诱导。在拟南芥中过量表达CiWRKY75后,与野生型拟南芥相比,转基因株系种子的萌发率在盐胁迫下降低,并且对盐胁迫的耐受能力明显减弱;ABA处理下,2个转基因株系的种子萌发率(10.3%、9.6%)较野生型(25.9%)明显降低。研究表明,CiWRKY75是中间锦鸡儿对盐和ABA响应的重要调控因子。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

枸杞WRKY_3基因克隆及组织表达分析

以枸杞为材料,采用PCR及RACE方法,克隆了枸杞WRKY转录因子基因cDNA序列,命名为Lb WRKY3,GenBank登录号为KX196192。在生物信息学分析的基础上,进行亚细胞定位、基因表达分析。结果显示:(1)Lb WRKY3开放阅读框ORF长度为1 068bp,编码356个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,Lb WRKY3编码蛋白具有一个WRKY结构域,二级结构中不规则卷曲结构所占比例最大(58.67%),延伸链结构次之(18.88%),α螺旋比例为15.82%,β转角最少,仅为6.63%;Lb WRKY3蛋白与案头菊WRKY蛋白、黄花蒿WRKY蛋白相似性较高。(3)亚细胞定位显示,Lb WRKY3蛋白定位于细胞核。(4)实时定量PCR分析表明,Lb WRKY3在根中表达量最高,在花中表达量最低;在枸杞果实发育过程中Lb WRKY3均有表达,表达量随果实成熟逐渐升高,并于35d达到峰值;Lb WRKY3基因在果实中的表达具有组织特异性表达特性(果肉果皮种子)。研究表明,Lb WRKY3基因参与了枸杞果实生长发育调控。     

Molecular cloning and characterization of a novel WRKY gene from Brassica chinensis

A new WRKY gene was cloned from Brassica chinensis by rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length cDNA of BcWRKY was 1175 bp long and contained a 924-bp open reading frame (ORF) encoding a putative W-box-binding protein of 308 amino acids. The predicted BcWRKY protein was found to have a potential bipartite nuclear localization sequence (NLS-PB) in its N-terminal region followed by a WRKY DNA-binding domain. Bioinformatic analysis revealed that BcWRKY resembled other WRKY domain-containing proteins from Arabidopsis thaliana (AtWRKY18), tobacco (WIZZ), parsley (PcWRKY4), and wild oat (ABF2). Expression of the BcWRKY gene could be induced by salicylic acid (SA) and influenced by Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 infection and wounding treatment. Our study implies that BcWRKY might have similar functions possessed by other WRKY genes, such as inducing the expression of some defense-related genes and increasing plants’ disease resistance ability. Published in Russian in Molekulyarnaya Biologiya, 2006, Vol. 40, No. 5, pp. 816–824. The text was submitted by the authors in English.