miRNA-21靶向调控Wnt/β-catenin对非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响

目的研究microRNA-21(miR-21)是否通过调控wnt/β-catenin信号通路从而影响人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞株NCI-H1975细胞体外增殖与侵袭能力。方法预测和构建含有miR-21候选靶基因和β-连环蛋白基因的双荧光素酶报告质粒。将miR-21模拟物通过Lipofactamine 2000脂质体转染法转染NCI-H1975细胞,应用qRTPCR检测细胞中miR-21和β-catenin mRNA表达情况,应用Western blot检测β-catenin蛋白水平,CCK-8法检测miR-21mimic对NCI-H1975细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测miR-21 mimic对NCI-H1975细胞侵袭能力的影响。结果qRT-PCR肺癌组织中的miR-21与邻近正常组织相比表达明显升高;双荧光素酶报告基因结果显示miR-21能和β-catenin的3’UTR端结合且显著促进荧光素酶活性;上调miR-21可使β-catenin的mRNA和蛋白表达水平显著升高,同时上调miR-21可显著增强NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力。结论 miR-21在转录后水平调控β-catenin表达来促进NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力,可能是NSCLC潜在的治疗靶点。     

胶质瘤细胞中miR-223对PAX6基因3'非翻译区的调控作用

目的:明确miR-223在胶质瘤细胞中对PAX6基因3'-UTR的靶向调控作用。方法:生物信息学软件预测PAX6基因3'-UTR的靶向miRNAs;分别构建野生型和突变型PAX6基因3'-UTR双荧光素酶报告基因质粒;共转染miR-223 mimics与野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒于U251细胞中,双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性。结果:生物信息学软件预测显示PAX6可能是miR-223的靶基因;与转染野生型PAX6 3'-UTRpsiCHECKTM-2质粒组和转染突变型PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2质粒组相比,miR-223 mimics能明显降低野生型荧光素酶质粒活性。结论:miR-223能够靶向负性调控PAX6基因3'-UTR的活性。     

miR-155靶向SOCS1对骨肉瘤Saos2细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨microRNA-155(miR-155)对骨肉瘤Saos2细胞增殖、侵袭和迁移的影响以及其作用机制。方法:利用实时荧光定量(qRT-PCR)实验检测miR-155在正常成骨细胞与骨肉瘤Saos2细胞中的表达水平,以及miR-155-mimic、miR-155-inhibitor的转染效率。采用CCK-8实验检测细胞的增殖能力,Transwell实验和划痕实验分别检测Saos2细胞的侵袭和迁移能力,Western blot检测细胞内的STAT3磷酸化水平以及SOCS1表达水平,双荧光素酶报告基因实验进行靶基因验证。结果:miR-155在骨肉瘤Saos2细胞中表达明显高于正常成骨细胞(P0.001)。在分别转染miR-155-mimic和miR-155-inhibitor后,Saos2细胞内miR-155表达水平明显上调和下降(P0.001)。过表达miR-155可促进Saos2细胞增殖、侵袭和迁移,降低SOCS1的蛋白水平,上调STAT3的磷酸化水平,差异均具有统计学意义。相反,降低miR-155水平可抑制Saos2细胞的增殖、侵袭和迁移能力,差异均具有统计学意义。结论:骨肉瘤Saos2细胞中高表达的miR-155可以通过抑制SOCS1表达来激活STAT3信号通路进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移,因此,靶向抑制miR-155表达可以作为潜在治疗骨肉瘤的途径。     

circ_0001461靶向抑制miR-30a-5p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

摘要 目的：探讨circ_0001461对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及调控机制。方法：采用实时荧光定量聚合酶反应（qRT-PCR）检测检测circ_0001461在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平。在U2OS和HOS细胞中转染sh-NC和sh-circ_0001461后,采用CCK8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,qRT-PCR检测增殖相关分子Ki-67 mRNA的表达水平,Western Blot检测凋亡相关分子Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。采用双荧光素酶报告基因检测circ_0001461和miR-30a-5p的结合情况。结果：circ_0001461在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）,circ_0001461在骨肉瘤细胞U2OS和HOS中的表达水平均明显高于成骨细胞NHOst（P<0.05）。低表达circ_0001461能够抑制骨肉瘤细胞U2OS和HOS的增殖和增殖相关分子Ki-67的表达（P<0.05）;促进骨肉瘤细胞U2OS和HOS的凋亡和凋亡相关分子Cleaved-caspase-3蛋白的表达（P<0.05）。双荧光素酶结果显示circ_0001461能够靶向结合miR-30a-5p。低表达circ_0001461能够促进miR-30a-5p的表达（P<0.05）,circ_0001461和miR-30a-5p在骨肉瘤组织中的表达呈负相关（P<0.05）。在U2OS细胞中共转染sh-circ_0001461和miR-30a-5p mimics后能够进一步加强单独转染sh-circ_0001461对U2OS细胞增殖和凋亡的影响（P<0.05）;在HOS细胞中共转染sh-circ_0001461和miR-30a-5p inhibitors后能够逆转单独转染sh-circ_0001461对U2OS细胞增殖和凋亡的影响（P>0.05）。结论：circ_0001461在骨肉瘤组织和细胞中明显高表达,低表达circ_0001461能够靶向促进miR-30a-5p的表达进而抑制骨肉瘤细胞增殖和促进细胞凋亡。     

MiRNA-155通过调控β-catenin促进结肠癌SW480细胞的侵袭

目的:探讨micro RNA-155(miR-155)对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响及其可能机制。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定结肠癌组织与邻近正常结肠组织中miR-155的表达。将miR-155 mimic和β-catenin特异性的siRNA(β-catenin si RNA)分别通过脂质体转染法转染入结肠癌SW480细胞,应用RT-PCR检测细胞中miR-155和β-catenin m RNA的表达,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测β-catenin蛋白表达,采用Transwell侵袭实验检测miR-155 mimic及β-catenin si RNA对SW480细胞侵袭能力的影响。结果:结肠癌组织中的miR-155的表达较邻近正常结肠组织明显升高(P0.05);miR-155 mimic可使β-catenin的m RNA和蛋白表达均显著升高(P0.05),同时可显著增强SW480细胞的侵袭能力(P0.05),而转染miR-155 mimic和β-catenin si RNA的SW480细胞侵袭能力较仅转染miR-155 mimic的SW480细胞显著减弱(P0.05)。结论:结肠癌组织中miR-155的表达上调,可能通过激活B-catenin信号通路促进肿瘤细胞的远处侵袭转移。     

miR-133a mimics对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡作用的影响

目的:研究采用miR-133a mimics瞬时转染骨肉瘤细胞系MG63对其细胞增殖和凋亡作用的影响.方法:采用miR-133a mimics瞬时转染骨肉瘤细胞系MG63,以miR-negative control(NC)mimics作为阴性对照.通过RT-PCR法检测miR-133a在转录水平的表达,CCK法检测其对增殖的影响,采用流式细胞仪检测miR-133a mimics对MG63细胞凋亡作用的影响.利用生物信息学方法预测miR-133a的靶基因,并对其靶基因进行基因功能分析.结果:(1)miR-133a mimics成功转染MG63细胞,并经RT-PCR检测可有效表达.(2)转染48h后,miR-133a mimics组与miR-NC mimics组比较,增值活性明显降低(P＜0.01).(3)miR-133amimics组与miR-NC mimics组和正常细胞相比,其凋亡率显著上升(P＜0.01).(4)生物信息学方法预测miR-133a的靶基因,部分发挥抑制细胞增殖和凋亡的作用.结论:miR-133a对人骨肉瘤细胞MG63的增殖和凋亡能力可能存在调控作用,可能成为骨肉瘤治疗的潜在候选靶点.     

miRNA-132抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力

目的观察miRNA-132在不同骨肉瘤细胞系中的表达及对骨肉瘤细胞生物学行为的影响,探讨miRNA-132在人骨肉瘤发生发展中的作用。方法通过荧光定量PCR技术检测不同骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中miRNA-132的表达情况,使用pRFP-miRNA-132-down质粒转染U2OS细胞、pRFP-miRNA-132-up质粒转染143B细胞,使用EdU检测肿瘤细胞增殖状态,Transwell小室检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力。结果在3种骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中,miRNA-132的表达依次下降(U2OSMG63143B);降低miRNA-132在U2OS细胞中的表达促进细胞的增殖和侵袭能力,增加miRNA-132在143B细胞中的表达抑制细胞的增殖和侵袭能力。结论 miRNA-132可能通过抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭调节骨肉瘤的发生发展。     

miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。     

miR-20a靶向CCND1作用PI3K/AKT信号通路抑制皮肤鳞状细胞癌的发展

摘要 目的：探究miR-20a与CCND1蛋白在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中的作用关系,以及其可能涉及的信号通路分子机制。方法：分别收集皮肤鳞状细胞癌患者的皮肤癌组织及其邻近正常皮肤组织,采用qRT-PCR分析组织中miR-20a和CCND1基因表达水平。为探究miR-20a对CSCC细胞的影响,将SCL-1细胞分为对照组（不转染）、miR-NC组（转染miR-NC）和miR-20a mimics组（转染miR-20a mimics）;为探究CCND1与PI3K/AKT信号通路的关系,将SCL-1细胞分为对照组（不转染）、si-NC组（转染si-NC）和si-CCND1组（转染si-CCND1）;为探究miR-20a与CCND1间的作用关系及对CSCC细胞的影响,将SCL-1细胞分为miR-NC组（转染miR-NC）、miR-20a mimics组（转染miR-20a mimics）、mimics+pcDNA组（共转染miR-20a mimics和pcDNA）和mimics+CCND1组（共转染miR-20a mimics和pcDNA-CCND1）。采用Western blot分析p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GSK-3β蛋白表达水平;采用MTT检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Transwell分析细胞迁移和侵袭情况;采用双荧光素酶报告基因检测分析miR-20a与CCND1的靶向关系。结果：CSCC癌组织和SCL-1中miR-20a均低表达,CCND1高表达。与对照组和miR-NC组比较,miR-20a mimics组SCL-1细胞增殖水平以及侵袭和迁移数量均降低（P<0.05）,SCL-1细胞凋亡水平升高（P<0.05）,PI3K和AKT蛋白磷酸化水平降低（P<0.05）。TargetScanHuman数据库分析和双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-20a与CCND1存在靶向作用关系。与对照组和si-NC组比较,si-CCND1组SCL-1细胞中CCND1和GSK-3β蛋白表达水平以及PI3K和AKT蛋白磷酸化水平均降低（P<0.01）。与miR-20a mimics组或mimics+pcDNA组比较,mimics+CCND1组SCL-1细胞增殖水平以及侵袭和迁移数量均升高（P<0.05）,SCL-1细胞凋亡水平降低（P<0.05）,PI3K和AKT蛋白磷酸化水平均升高（P<0.05）。结论：过表达miR-20a可能通过靶向抑制CCND1的表达而抑制PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制CSCC细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进癌细胞凋亡。     

miR-613通过靶向VEGFA抑制神经胶质瘤细胞的增殖、侵袭和血管生成

摘要 目的：旨在探究miR-613在胶质瘤中的表达及对细胞增殖、侵袭和血管生成的影响。方法：根据细胞转染将实验分组为对照miRNA组（Control组）、miR-613模拟物组（mimics组）和miR-613 mimics+VEGFA组（VEGFA组）。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测胶质瘤细胞和组织中miR-613和VEGFA mRNA的表达水平;采用荧光素酶报告基因分析miR-613与血管内皮生长因子（VEGF）的关系;采用Western blotting检测VEGFA蛋白的表达水平;通过体外实验检测转染细胞的增殖能力、侵袭能力和管状形成能力。结果：与正常组织样本相比,胶质瘤I-II期组样本的肿瘤细胞呈现异形,具有深核染色,并且肿瘤细胞密度适度较低,而胶质瘤III-IV期组样本的肿瘤细胞的核分裂活跃,具有明显的微血管增殖和明显的细胞异型性;miR-613在胶质瘤I-IV期组织样本中显著降低（P<0.05）。在U87和U251细胞系的VEGFA-WT组中,与Control组相比,mimics组的荧光素酶活性显著降低（P<0.05）。与Control组相比,U87和U251细胞系中mimics组VEGFA的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。克隆形成实验、血管生成实验和细胞侵袭实验结果表明,与Control组相比,mimics组的克隆形成数量、细胞侵袭数、内皮细胞HUVEC的管状形成数和Ang-2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与mimics组相比,VEGFA组克隆形成数量、细胞侵袭数、内皮细胞HUVEC的管状形成数和Ang-2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。结论：miR-613通过靶向VEGFA抑制了神经胶质瘤细胞的侵袭、增殖和血管生成,提示miR-613可能成为未来治疗胶质瘤的潜在靶点。     

lncRNA ROR1-AS1通过靶向miR-758-3p调控神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

该研究旨在探讨ROR1-AS1对神经母细胞瘤细胞SK-N-SH增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及作用机制。收集67例神经母细胞瘤组织和瘤旁组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测组织中ROR1-AS1和miR-758-3p的表达情况。转染ROR1-AS1小干扰RNA、miR-758-3p模拟物或共转染ROR1-AS1小干扰RNA与miR-758-3p抑制剂至SK-N-SH细胞,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况。双荧光素酶报告基因实验验证ROR1-AS1和miR-758-3p的调控关系。结果显示,神经母细胞瘤组织中ROR1-AS1的表达明显高于瘤旁组织,而miR-758-3p表达明显低于瘤旁组织。抑制ROR1-AS1表达或过表达miR-758-3p降低了SK-N-SH细胞活性、迁移数和侵袭数及CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,而提高了细胞凋亡率及p21和Bax蛋白表达水平。ROR1-AS1在SK-N-SH细胞中靶向负调控miR-758-3p表达,干扰miR-758-3p可逆转抑制ROR1-AS1对SK-N-SH细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。这提示抑制ROR1-AS1表达可能通过靶向上调miR-758-3p阻碍SK-N-SH细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡,ROR1-AS1有可能成为神经母细胞瘤治疗的分子靶点。     

miR-223在结肠癌组织中的表达及促进结肠癌细胞迁移侵袭的机制研究

目的:探讨微小RNA-223 (mi R-223)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响及机制。方法:检测mi R-223在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。通过脂质体转染法将mi R-223模拟物(mi R-223 mimics,mi R-223 mimics组)及microRNA无关序列(mi R-223 NC,NC组)转染入结肠癌HT-29细胞。采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R-223和TWIST的表达,Western blot检测TWIST的蛋白表达,Tranwell检测细胞的迁移与侵袭能力。双荧光素酶报告基因检测mi R-223对TWIST基因启动子活性的影响。采用Transwell迁移与侵袭实验检测mi R-223 mimic及Twist si RNA共转染后人结肠癌细胞系HT-29迁移与侵袭能力的变化。结果:与癌旁结肠组织比较,mi R-223在结肠癌组织中呈现明显高表达(P0.05);与空白对照组和mi R-223 NC组比较,转染mi R-223 mimics后的HT-29细胞中的mi R-223表达显著增加(P0.05)。与阴性对照组和空载转染组相比较,mi R-223 mimics转染组穿透的细胞数目明显增加(P0.05),且mi R-223 mimics转染组的细胞侵袭能力显著增强(P0.05)。与mi R-223 NC组和空白对照组比较,转染mi R-223 mimics的HT-29细胞的TWIST基因m RNA和蛋白表达均显著增加(P0.05)。双荧光素酶检验结果显示TWIST为mi R-223的下游靶基因。共转染TWIST si RNA和mi R-223 mimics的结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭能力较单独转染mi R-223 mimics的HT-29细胞显著减弱(P0.05)。结论:mi R-223可能通过上调下游靶基因TWIST水平促进结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭。     

miR-93-5p通过靶向CDKN1A促进多囊卵巢综合征颗粒样瘤细胞KGN的生长增殖

目的:验证CDKN1A是miR-93-5p直接调控的靶基因,阐明miR-93-5p可通过靶向CDKN1A促进人卵巢颗粒样肿瘤细胞系KGN的生长增殖。方法:选取我院2016年6月-2019年6月期间确诊的40例多囊卵巢综合征(PCOS)患者作为研究对象,q RT-PCR检测PCOS病变卵巢组织和病灶旁正常卵巢组织(对照)中miR-93-5p和CDKN1A的表达水平。TargetScan软件用以预测miR-93-5p靶基因,并使CDKN1A所含3’-UTR克隆至目的基因下游(CDKN1A-wt或CDKN1A-mut),并分别与miR-93-5p模拟物(miR-93-5p mimics)以及其无关对照寡核苷酸序列(scramble)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因,q RT-PCR和Western blot分别检测转染miR-93-5p mimics及其对照scramble-1、miR-93-5p抑制剂(miR-93-5p inhibitor)及其对照scramble-2后的m RNA和蛋白表达水平。MTT实验验证分别转染miR-93-5p mimics、scramble、CDKN1A质粒(pcDNA3.1-CDKN1A)、空载体vector(pcDNA3.1)、miR-93-5p+CDKN1A质粒、scramble+vector质粒到KGN细胞中后细胞的生长增殖活性。结果:miR-93-5p在PCOS病变卵巢组织中的表达水平显著高于正常卵巢组织,CDKN1A在PCOS患者卵巢组织中的表达水平显著低于正常卵巢组织(均P<0.05)。在共转染miR-93-5p mimics和CDKN1A-wt、scramble和CDKN1A-wt的两组中,与共转染scramble和CDKN1A-wt组相比,共转染miR-93-5p和CDKN1A-wt组的荧光素酶活性强度降低了约40.9%(P<0.05)。转染miR-93-5p mimics后,CDKN1A的m RNA和蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);转染miR-93-5p inhibitor后,CDKN1A的m RNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。在细胞增殖实验中,转染miR-93-5p mimics后,KGN细胞的生长速度显著高于scramble组(P<0.05);与vector组比,转染CDKN1A可显著抑制KGN细胞的生长(P<0.05);同时转染miR-93-5p mimics和CDKN1A后,miR-93-5p对细胞增殖的促进作用降低(P<0.05)。结论:miR-93-5p通过靶向调控CDKN1A表达而促进人卵巢颗粒样肿瘤细胞系KGN的生长增殖。     

miR-182靶向抑制FBXW7表达影响非小细胞肺癌细胞增殖研究

目的:研究microRNA-182(miR-182)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达,并探讨其对NSCLC细胞增殖的影响及作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测miR-182在11例NSCLC及相应癌旁组织中的表达情况;Western blot检测FBXW7,c-Jun,c-Myc及cyclin D蛋白的表达;将miR-182模拟物,抑制物及相应空白对照瞬时转染H460细胞后,以细胞增殖与活性检测和克隆形成实验检测细胞系的增殖情况;流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化;荧光素酶报告基因实验证实miR-182对FBXW7的靶向性作用。结果:NSCLC组织中miR-182的相对表达水平显著高于癌旁组织(P0.05)。转染组与对照组相比,H460细胞生长、克隆形成能力显著增强,细胞周期进程加快,细胞凋亡受到抑制(P0.05)。在NSCLC组织中,FBXW7蛋白的表达水平明显低于癌旁组织(P0.05)。miR-182 mimics显著降低野生型FBXW7质粒荧光素酶的活性,然而将结合位点突变后,miR-182 mimics则不再影响荧光素酶的活性。结论:miR-182在NSCLC组织中高表达,与FBXW7之间存在靶向关系,通过下调FBXW7蛋白表达促进NSCLC细胞的增殖,参与肿瘤的发生发展,预示其可能成为一种潜在的生物标志和治疗靶点。     

双荧光素酶报告系统鉴定miR-204对水通道蛋白1基因的调控作用

[目的]构建水通道蛋白1(AQP1)基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-204与AQP1基因的靶向调控关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-204与AQP1基因的结合位点;荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染miR-204抑制剂前后miR-204及AQP1在K562细胞中的表达改变;构建AQP1-3'UTR野生型及突变型重组质粒,与miR-204、阴性对照共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]转染miR-204抑制剂后,miR-204表达量较阴性对照及空白对照组明显下降,分别为1. 97、9. 32、11. 25(P 0. 01);而AQP1基因表达显著增高,分别为13. 14、2. 29、2. 54(P 0. 01);酶切及测序结果表明已成功构建psi CHECKTM-2-AQP1 3'-UTR野生型和突变型重组质粒。荧光素酶活性结果表明,miR-204可使野生型AQP1 3'-UTR质粒荧光素酶活性降低约65. 9%,而对突变型质粒荧光素酶活性没有显著影响。[结论]成功构建了AQP1基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-204对AQP1存在靶向调控。     

miR-29a靶向调控PDGFB促进非小细胞肺癌细胞凋亡

为了探究miR-29a对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制,本研究通过荧光定量PCR检测肺癌组织、癌旁组织、肺癌细胞以及人正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B中miR-29a的表达,在肺癌A549转染miR-29a mimics后,使用荧光定量PCR和CCK-8法分别检测miR-29a的表达以及各组细胞的活力,使用流式细胞术检测A549细胞凋亡;通过荧光定量PCR检测肺癌组织、癌旁组织PDGFB m RNA的表达,采用Western blot检测PDGFB蛋白的表达;使用双荧光素酶报告基因检测miR-29a可能的靶基因;在肺癌A549细胞转染miR-29a mimics后继续转染PDGFB过表达质粒,通过qPCR和Western blotting分别检测PDGFB mRNA和蛋白的表达。结果表明,与癌旁组织相比,miR-29a在肺癌组织的表达显著下调(p<0.01),PDGFB在肺癌组织的表达显著增加(p<0.01);转染miR-29a mimics后,肺癌A549细胞中miR-29a表达显著增加(p<0.01);CCK-8法结果显示miR-29a mimics组A549肺癌细胞在24 h和48 h后细胞增值率较miR-NC对照组显著降低(p<0.01);流式细胞术结果显示miR-29a mimics组的细胞凋亡率较miR-NC对照组显著增加(p<0.01);与miR-NC+PDGFB 3’UTR WT组相比,miR-29a mimics+PDGFB 3’UTR WT组的荧光强度显著降低(p<0.01);荧光定量PCR和Western blotting显示miR-29a mimics+PDGFB组PDGFB m RNA和蛋白表达量与miR-29a mimics+vector组相比显著增加(p<0.01)。本研究结果表明miR-29a在肺癌组织和肺癌细胞株中低表达,及抑制PDGFB的表达并且促进肺癌细胞凋亡。     

RORα高表达抑制人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路靶基因表达

该文探讨了RORα(retinoid acid receptor related orphan receptorα)高表达对人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路靶基因的作用。采用MTT检测了MGC803细胞增殖。采用RT-PCR、Western blot与免疫共沉淀检测了Wnt/β-catenin信号通路相关分子与靶基因表达。荧光素酶报告基因方法检测c-Myc基因启动子活性。MTT结果显示,RORα高表达人胃癌MGC803细胞的增殖能力较对照组明显减弱(P0.05)。RT-PCR与Western blot结果显示,RORα高表达组Wnt1m RNA与蛋白质水平较对照组下调(P0.05),而β-catenin m RNA与蛋白质水平无差异(P0.05)。免疫共沉淀结果显示,RORα高表达组RORα与β-catenin结合明显增加(P0.05)。RORα高表达可显著下调核内β-catenin水平(P0.05),同时可显著下调TCF-4(T cell factor-4)蛋白质水平(P0.05)。RORα高表达可显著下调Axin、c-Myc、c-Jun m RNA与蛋白质水平(P0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,RORα高表达c-Myc启动子活性明显降低(P0.05)。以上结果表明,RORα高表达可通过调控Wnt/β-catenin信号通路相关分子基因表达来抑制人胃癌细胞增殖。     

miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的实验研究

目的:研究miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的分子机制。方法:选取MGC803及NCI-N87细胞,根据转染不同分为:miR-NC组(空质粒),miR-195-mimics组(模拟序列)。实时荧光定量PCR法检测miR-195表达;MTT检测细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力;细胞划痕实验检测细胞转移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测chemokine 5表达水平;Spearman相关分析miR-195及chemokine 5相关性。荧光素酶实验验证miR-195与chemokine 5的靶向关系。结果:miR-195-mimics组细胞miR-195水平高于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组第1、2、3、4 d细胞活力低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组G1细胞高于miR-NC组,G2期、S期细胞低于miR-NC组,G2/S期细胞比值低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组划痕距离大于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组细胞侵袭数低于miR-NC组(P0.05);miR-195-mimics组细chemokine 5蛋白含量低于miR-NC组(P0.05);miR-195 m RNA水平与chemokine 5蛋白含量负相关(r=-0.398,P=0.00);miR-195可直接靶向chemokine 5。结论:miR-195可通过靶向chemokine 5促进胃癌MGC803及NCI-N87细胞的增殖、转移及侵袭。     

miR-92在膀胱癌患者中的表达与膀胱癌细胞侵袭和耐药性的关系

为了考察miR-92在膀胱癌患者中的表达及与膀胱癌细胞侵袭和耐药性的关系,本研究通过RT-PCR检测了膀胱癌患者癌组织和BIU-87细胞中的miR-92表达,通过对BIU-87细胞转染miR-92抑制剂来敲低miR-92的表达。使用10μg/mL的顺铂处理BIU-87细胞24 h、48 h和72 h,Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)检测细胞活力。基质胶侵袭实验检测侵袭能力,Annexin V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blotting检测GSK3β、细胞核β-catenin、Cyclin D1、c-myc和MMP7的表达。研究显示,膀胱癌组织和细胞中miR-92的表达上调且与TNM分期和淋巴结转移相关。敲低miR-92抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化,并降低膀胱癌细胞的顺铂耐药性。敲低miR-92导致Cyclin D1、c-myc、MMP7和细胞核β-catenin的表达水平显著降低,而GSK3β的表达水平显著升高。本研究表明,miR-92在膀胱癌患者中明显上调,敲低miR-92可抑制膀胱癌细胞的增殖、转移和上皮-间质转化,并提高化疗药物敏感性。miR-92对膀胱癌细胞生物学行为的调控作用部分由Wnt信号通路相关分子(如GSK3β等)介导。     

盐酸罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制*

目的:探讨盐酸罗哌卡因对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及分子机制。方法:采用逐步增加药物剂量诱导法建立骨肉瘤多柔比星耐药细胞株(U2OS/DOX),用浓度分别为0、20、50、100 μg/ml的盐酸罗哌卡因处理U2OS/DOX细胞,作为不同浓度盐酸罗哌卡因处理组;将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Livin转染至U2OS/DOX细胞中再用浓度为100 μg/ml的盐酸罗哌卡因处理,记为盐酸罗哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1组、盐酸罗哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin组。MTT检测细胞增殖抑制率及细胞半数抑制浓度(IC₅₀);蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、Livin蛋白表达;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Livin mRNA表达水平。结果:多柔比星浓度大于1 μg/ml时,骨肉瘤细胞U2OS增殖抑制率显著升高,且具有剂量依赖性(P＜0.05);多柔比星浓度大于10 μg/ml时,骨肉瘤细胞骨肉瘤耐药细胞U2OS/DOX增殖抑制率显著升高,且具有剂量依赖性(P＜0.05)。盐酸罗哌卡因处理的U2OS/DOX细胞中P21、Caspase-3、E-cadherin表达水平显著升高,MMP-2表达水平显著降低,细胞增殖抑制率显著升高,克隆形成数显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞迁移、侵袭数显著降低,Livin表达水平显著降低,且呈浓度依赖性(P＜0.05)。过表达Livin部分逆转了盐酸罗哌卡因对细胞U2OS/DOX增殖、迁移、侵袭的抑制作用及凋亡的促进作用。结论:盐酸罗哌卡因能明显抑制对多柔比星具有耐药性的骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,明显促进骨瘤细胞凋亡,其机制可能与Livin有关。