HIV-1 Tat蛋白对人类疱疹病毒8型复制的影响

用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白(GFP)编码基因从表达质粒pcDNA3．1 ／GFP中切出,分别插入到质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS—Tat101和LZRS—GFP。采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env,gal和pol编码基因的包装细胞Phoenix(φNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清,并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)BC2BL-1细胞。收集LZRS—GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数,检测GFP表达水平。收集LZRS—Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞,提取蛋白作Western blot,检测Tat蛋白表达状况;取细胞总RNA作Northem blot和定量PCR,检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录水平。重组LZRS—Tat101病毒进一步感染HL3T1细胞(HeLa细胞包含HIV-1-LTR／CAT报告基因),收集感染细胞提取蛋白,检测CAT活性,评价Tat生物学功能。PCR扩增HHV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列,并克隆至pGL-3载体中,构建Rta启动子 虫荧光素酶(Luciferase)报告基因重组质粒。此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS—Tat101病毒的BC-3细胞,TPA刺激后收集细胞,检测Luciferase活性。结果显示：①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞,一次感染效率达56％;②重组LZRS—Tat101毒能够在其感染的BCBL-1细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能;③Tat蛋白不能有效上调HHV-8Rta启动子活性;④细胞内HIV-1Tat蛋白诱导HHV-8可溶性周期复制的能力较弱。提示,单纯HIV-1Tat蛋白并不能激活潜伏感染的HHV-8。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一.本文通过构建p10 缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能.利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因, 然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上, 构建了p10缺失的重组HaBacΔp10- PH-eGFP.重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装.     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

一种1型单纯庖疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒（HSV-1）作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史. 本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统. 首先,将HSV-1内部反向重复序列（internal inverted repeat sequences, IR）两侧的片段克隆入pKO5获得穿梭质粒pKO5/BN,其电转含pHSV-BAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的 pHSVΔIR-BAC. pHSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR（MH1001）.上述pKO5/BN和含pHSVΔIR BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统. 利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP（MH1002）.MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异|Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降|免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧光蛋白表达水平的研究

构建了一系列含有编码硫氧还蛋白(Trx)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子重组表达质粒,重点考察双顺反子间紧密相连和重迭的间隔序列.诱导表达后,对表达的GFP进行荧光检测,利用GFP的荧光强度来反映蛋白质的表达水平.结果表明各表达载体所表达的GFP的平均荧光强度差距很大,表明双顺反子间的间隔序列对报告基因表达水平有一定的影响,为实现不同功能基因表达的精确调控奠定了基础.     

065绿色荧光蛋白报告系统用于单纯疱疹病毒感染的快速诊断和定量

单纯疱疹病毒(HSV)是免疫功能低下患者感染和死亡的常见原因之一,因而有必要对当前HSV的诊断方法进行改进.基于对HSV复制过程的了解,可以利用源于病毒启动子的转录来鉴定感染病毒的细胞.据此,已将多种报告基因,如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ及荧光素酶,与控制核糖核苷酸还原酶大亚基的启动子HSV-1的ICP6或HSV-2的ICP10相连,即可在HSV感染后几个小时之内诱导其特异性表达作为检测方法,有些已用于临床.然而,这些方法需要固定细胞、加入底物或制备细胞裂解物,给操作带来不便.本文利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告系统建立一种简便直接的方法,可连续监测活细胞中HSV的感染.EGFP较绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号强35倍,可用荧光显微镜和流式细胞仪488nm氩离子激发光进行检测.     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一。本文通过构建p10缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能。利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因,然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上,构建了p10缺失的重组HaBacΔp10-PH-eGFP。重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装。     

大麦黄矮病毒GAV株系ORF4基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及亚细胞定位

根据已报道的大麦黄矮病毒GAV株系(BYDV-GAV)相关基因序列,利用RT-PCR方法获得ORF4基因。在杆状病毒-昆虫细胞系统中,成功表达了ORF4和GFP(绿色荧光蛋白)的融合蛋白(GFP:ORF4),Western blot检测到目的蛋白的表达。利用激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的积累和亚细胞分布,发现ORF4基因编码的17kD蛋白(P4)能进入细胞核,并在细胞核膜上聚集。通过对ORF4基因编码的P4蛋白的N端和C端缺失突变结合蛋白质的结构预测分析,鉴定出N端α螺旋结构对于P4蛋白的核膜定位是必需的。这些结果为进一步研究ORF4基因在黄矮病毒GAV系统侵染中的生物学功能奠定了基础。     

大麦黄矮病毒GAV株系ORF4基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及亚细胞定位

根据已报道的大麦黄矮病毒GAV株系(BYDV-GAV)相关基因序列,利用RT-PCR方法获得ORF4基因。在杆状病毒-昆虫细胞系统中,成功表达了ORF4和GFP（绿色荧光蛋白）的融合蛋白(GFP: ORF4),Western blot检测到目的蛋白的表达。利用激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的积累和亚细胞分布,发现ORF4基因编码的17 kD蛋白（P4）能进入细胞核,并在细胞核膜上聚集。通过对ORF4基因编码的P4蛋白的N端和C端缺失突变结合蛋白质的结构预测分析,鉴定出N端α螺旋结构对于P4蛋白的核膜定位是必需的。这些结果为进一步研究ORF4基因在黄矮病毒GAV系统侵染中的生物学功能奠定了基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

粟酒裂殖酵母中Mef2在线粒体中功能的研究

由核编码基因控制的线粒体翻译对线粒体中电子传递链复合物的合成是必不可少的。旨在揭示粟酒裂殖酵母中Mef2蛋白的主要功能。利用同源重组的方法构建Δmef2突变体,观察Δmef2在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基的生长表型;生物信息学分析结果显示Mef2的N端含有一段由31个氨基酸组成的线粒体定位序列(MTS),为进一步确定Mef2蛋白的定位,在Mef2的C端添加一个GFP荧光标记,观察GFP绿色荧光的位置。接着采用Northern blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码m RNAs的影响。最后,运用Western blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码的蛋白的影响。研究结果表明,Δmef2菌株在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷型菌;GFP绿色荧光定位实验证实了Mef2定位于线粒体中;Northern blotting实验结果显示mef2的缺失不影响线粒体基因组编码m RNAs的转录;Western blotting检测结果显示mef2的缺失导致Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白的表达量降低。综上所述,Mef2是一个与线粒体功能密切相关的蛋白,并且参与了线粒体编码蛋白Cox1、Cox3、Atp6和Cob1的翻译。     

文昌鱼GFP基因的鉴定及表达分析

近年在隶属头索动物亚门的文昌鱼体内发现有内源性绿色荧光蛋白存在,并发现文昌鱼荧光蛋白的发光现象在不同发育时期以及个体间有较大的差异。为了进一步揭示GFP基因在文昌鱼中的进化模式,探索其可能执行的功能,该文首先对白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)GFP基因作了全面鉴定,并对其不同发育阶段胚胎及成体不同区域中的荧光信号进行了实时观察记录,进而对GFP基因在绿色荧光表达强烈的两个特定时期做了绝对定量检测。研究结果表明,文昌鱼基因组中至少有12个内源性GFP基因,在个体发育的不同时期,内源性荧光出现的位置有所变化,而且在变态后的个体之间出现荧光的情况差异较大,荧光蛋白基因的表达由多个GFP同源基因共同参与,这些基因在不同的发育时期表达量有较大的差异,提示不同的GFP基因在特定发育阶段可能行使各自的功能。     

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白报告基因重组禽腺联病毒载体系统的构建与鉴定

为了开展重组禽腺联病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)介导的基因转移研究,用限制性内切酶消化含AAAV全基因组的重组质粒pCR-AAAV,去除AAAV Rep和Cap蛋白编码序列,将PCR扩增的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因插入AAAV末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)之间,获得表达GFP基因的AAAV转移载体pAITR-GFP;以含AAAV全基因组的质粒为模板,用PCR分别扩增AAAV Rep、Cap和Rep-Cap蛋白基因,将Rep和Cap基因分别插入真核细胞双表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点,将Rep-Cap蛋白基因插入真核细胞表达载体pcDNA3,获得AAAV辅助质粒pVITRO2-ARC和pcDNA-ARC;将pAITR-GFP、pVITRO2-ARC或pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒转染系统,用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,获得了表达GFP的rAAAV.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,纯化病毒出现分子量正确的VP1、VP2、VP3结构蛋白;经PCR检测证明,重组病毒中含有GFP报告基因;用重组病毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝CEL细胞,可以观察到GFP报告基因的表达,表达时间持续两周以上.这些试验结果表明,成功建立了辅助病毒非依赖性rAAAV体外包装体系,为禽源细胞的基因转移研究和禽重组活载体疫苗的研制打下了基础.     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。     

乙型脑炎病毒表达载体的研究

用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株5′、3′NCR,利用融合PCR技术在5′、3′NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5′NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR。分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋门编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体：pMR—GFP和pMR-84FliS。绎荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14—14—2感染的BHK-21细胞中表达。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统.我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155.将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象.板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料.