中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因的分子特性及功能

【目的】通过研究中华稻蝗Oxya chinensis几丁质脱乙酰基酶1 (chitin deacetylase 1, CDA1)基因的分子特性和生物学功能, 为新型农药靶标筛选提供理论基础。【方法】在中华稻蝗转录组数据库搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因片段, 用生物信息学方法对其进行同源比对分析并作聚类关系图; 利用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）获得该基因cDNA全长序列; 通过Real-time quantitative PCR(qPCR)方法检测OcCDA1在5龄若虫不同组织部位和不同发育时期的表达情况, 并采用RNAi技术研究OcCDA1在飞蝗生长发育中的功能。【结果】获得中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因全长cDNA,命名为OcCDA1（GenBank登录号：KP271171）。OcCDA1在前肠、体壁、后肠和脂肪体组织中高表达, 在5龄第1天表达量显著高于以后几天。RNAi结果显示, 注射该基因的dsRNA后, OcCDA1基因的表达量降低了93.3%。OcCDA1基因沉默后虫体出现进食减少、发育迟缓现象, 总死亡率达到95.2%,其中38.1%的试虫在蜕皮前死亡, 57.1%出现因蜕皮困难而死亡的表型。【结论】OcCDA1在中华稻蝗的发育中起着重要作用, 该基因沉默引起虫体进食减少和蜕皮异常从而导致死亡。     

飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

棉铃虫Ⅳ型几丁质酶的基因克隆、酶学性质及表达谱

【目的】昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigera Ⅳ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树。在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Western blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质。qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号: MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD。蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain, CAD), C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain, CBD)。多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶。重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达。纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数K_m和V_max值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s。qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达。【结论】结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程。这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息。     

荒漠甲虫小胸鳖甲低温响应几丁质酶基因Mpcht19的克隆及表达模式分析

【目的】探索荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis低温响应的分子机理并挖掘其耐寒基因。【方法】根据低温转录组数据筛选并克隆小胸鳖甲几丁质酶基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分析该基因在成虫不同组织中和4℃低温胁迫下的表达模式分析。【结果】从小胸鳖甲成虫克隆获得一个几丁质酶基因Mpcht19(Gen Bank登录号:KY126382)。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白Mp CHT19属于Ⅳ型昆虫几丁质酶,理论分子量约为27.18 k D,无信号肽,具亲水性。系统进化分析表明,Mp CHT19与赤拟谷盗Tribolium castaneumⅣ型几丁质酶Tc CHT19同源性最高,氨基酸序列一致性为34.05%。实时荧光定量PCR结果显示,Mpcht19在成虫脂肪体和后肠中高表达,具有组织特异性;该基因的表达还受4℃低温诱导。免疫组织化学分析结果显示,在4℃低温下Mp CHT19蛋白在脂肪体和后肠中表达。【结论】Mpcht19基因的表达具有组织特异性,并受低温诱导。研究结果有助于深入研究几丁质酶与小胸鳖甲耐寒性的关系。     

欧洲型舞毒蛾气味受体基因OrCo的克隆及序列分析

【目的】克隆欧洲型舞毒蛾Lymantria dispar Linnaeus的OrCo气味受体基因,并分析其序列特征,为进一步研究舞毒蛾嗅觉机制提供有益参考。【方法】本研究利用RT-PCR和RACE方法,克隆获得欧洲型舞毒蛾OrCo受体基因cDNA全长序列,将该基因命名为LdisOrCo,在GenBank中的登录号为KF482409。【结果】序列分析结果显示,LdisOrCo开放阅读框全长为1 311 bp,编码436个氨基酸,序列中有7个跨膜区和高度保守的C端区域。序列联配分析表明,LdisOrCo基因的氨基酸序列与近缘种灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis Or83b)的同源性高达89%,与鞘翅目台湾黑金龟(Holotrichia plumbea Or83b)同源性高达64%,与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性都在60%以上,特别是在C端几乎完全一致。【结论】嗅觉受体OrCo(Olfactory receptor coreceptor)在不同昆虫体内高度保守,克隆欧洲型舞毒蛾OrCo基因可以为进一步研究舞毒蛾气味受体的功能,OrCo基因的进化以及揭秘嗅觉机制奠定基础。     

点蜂缘蝽铁蛋白基因功能分析

【目的】铁蛋白（Ferritin）在维持生物铁稳态中起着重要作用。通过分析点蜂缘蝽Riptortus pedestris铁蛋白基因，揭示其对点蜂缘蝽的生物学影响，为进一步探究铁蛋白功能以及点蜂缘蝽防治提供参考。【方法】利用转录组和基因组数据鉴定点蜂缘蝽铁蛋白基因；通过转录组测序分析铁蛋白基因在不同龄期和不同组织的表达水平；对点蜂缘蝽若虫分别注射铁蛋白基因dsRNA进行基因沉默。【结果】本研究鉴定到了3个点蜂缘蝽铁蛋白基因，分别是铁蛋白重链亚基（RpFer1）、铁蛋白轻链亚基（RpFer2）和体铁蛋白（Rpsoma-Fer）。3种铁蛋白基因在各个龄期均有表达，RpFer1和RpFer2的表达随昆虫蜕皮呈周期性变化，而Rpsoma-Fer的表达与昆虫蜕皮无明显相关性。组织特异性分析表明，3种铁蛋白在肠道、肌肉以及表皮组织中表达较高，而在唾液腺、精巢、卵巢的表达较低。RNA干扰结果表明，抑制RpFer1和RpFer2会导致点蜂缘蝽若虫蜕皮受阻，进而表现出高致死率，但抑制Rpsoma-Fer没有出现明显的表型变化。【结论】铁蛋白RpFer1和RpFer2在点蜂缘蝽的发育过程中不可或缺，可能在蜕皮过程中起重要作用，未来可以将其作为RNA干扰技术防治点蜂缘蝽的靶基因。     

马铃薯甲虫两个系统性RNA干扰缺失基因cDNA的克隆、序列分析和时空表达

【目的】克隆马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)两条Sid-1基因的全长并分析其时空表达。【方法】本研究通过RT-PCR和5'/3'RACE等技术从马铃薯甲虫中克隆全长序列,通过序列多重比对和系统发育分析研究序列的保守性和基因起源,通过阶段收样,组织解剖和qPCR技术获得这两个基因的时空表达。【结果】从马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的4龄幼虫中克隆得到LdeSid-1a和LdeSid-1c,其m RNA全长为2 887和3 733 bp,编码759和782个氨基酸,分子量为86.19和90.27 ku,两条蛋白质序列的相似性为59%。与其它昆虫的系统性RNA干扰缺失基因的比对结果显示,LdeSid-1a和LdeSid-1c分属于鞘翅目系统性RNA干扰缺失基因的两个分支,均具有典型的11个跨膜域结构,在蛋白质序列的N端具有4段高度保守的基序。qPCR的时序分析表明LdeSid-1a和LdeSid-1c的表达从初孵幼虫开始逐渐上升,而LdeSid-1c在卵中的表达也较高,组织中的分布结果表明,两个基因在所有组织中均表达,在前肠、中肠和后肠以及生殖系统中表达较高,在神经系统中为优势表达。LdeSid-1a和LdeSid-1c的Gen Bank登录号为KR153284和KR153285。【结论】LdeSid-1a和LdeSid-1c具有典型的系统性RNA干扰缺失基因家族的结构,时空表达和系统发育的结果均表明这两条基因可能在幼虫的高龄阶段起到重要作用。     

稻纵卷叶螟几丁质合成酶及合成通路相关酶基因的鉴定及表达分析

【目的】稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenee)是水稻上的四大害虫之一,危害较为严重,近年来以几丁质合成和代谢过程作为害虫防治的标靶研究已成为热点。为阐明几丁质合成酶及合成通路上关键酶的作用,本研究开展了对稻纵卷叶螟几丁质合成酶及合成相关通路上关键酶的克隆及时空表达分析。【方法】本研究基于稻纵卷叶螟转录组,结合PCR及RACE技术,克隆了几丁质合成酶代谢通路上的4条基因的c DNA全长;利用生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化分析;采用实时定量PCR技术研究了4条基因在不同虫态和幼虫的不同组织中的表达情况。【结果】获得了2条几丁质合成酶序列及2条合成通路上的基因序列,包括几丁质合成酶A(Chitin synthase A,CHSA),几丁质合成酶B(Chitin synthase B,CHSB),N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase,PGM和UDP-N-乙酰葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase,UAP),并分别命名为Cm CHSA、Cm CHSB、Cm PGM和Cm UAP;序列分析显示Cm CHSA序列全长4 868 bp,编码1 564个氨基酸。Cm CHSB序列全长4 651 bp,编码1 525个氨基酸。Cm PGM全长1 934 bp,编码548个氨基酸。Cm UAP序列全长1 837 bp,编码487个氨基酸。实时定量研究表明,Cm UAP和Cm PGM在血淋巴中表达量最高,Cm CHSA在头部和表皮中表达量较高,而Cm CHSB在中肠中表达量最高。【结论】本研究得到了稻纵卷叶螟几丁质合成路径的4个关键酶基因c DNA全长,它们在稻纵卷叶螟的不同组织和虫态中呈现了差异显著的时空表达,本文为进一步探究稻纵卷叶螟的几丁质合成酶的生理功能和几丁质的合成代谢途径奠定了基础。     

梨小食心虫几丁质合成酶1基因的克隆与表达分析

【目的】克隆梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶1基因,分析该基因的分子特征及时空表达模式,为探析其生理功能奠定基础。【方法】利用简并引物和RACE技术从梨小食心虫5龄幼虫和蛹中克隆几丁质合成酶1基因的全长c DNA序列,同时获得其两个可变剪切外显子序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统进化树。利用RTq PCR技术研究该基因及两个可变剪切外显子在1日龄预蛹不同组织(头、体壁、脂肪体、中肠、气管和马氏管)中以及不同发育阶段(2-5龄幼虫、预蛹、蛹和成虫)的表达特性。【结果】克隆获得梨小食心虫几丁质合成酶1基因,将其命名为Gm CHS1,该基因编码1 565个氨基酸,包含了16个跨膜螺旋,两个可变剪切外显子包含177个碱基,编码59个氨基酸序列,分别命名为Gm CHS1a(Gen Bank登录号:MF000781)和Gm CHS1b(Gen Bank登录号:MF000782)。系统发育树同源分析结果表明,Gm CHS1属于几丁质合成酶1,Gm CHS1a和Gm CHS1b分别归属于可变剪切外显子CHS1a和CHS1b。组织表达模式表明,Gm CHS1基因在体壁中表达量最高,其次是在头和气管中,其余组织中表达量较低或不表达;发育表达模式表明,该基因在各个发育阶段均有表达,幼虫蜕皮期、预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中表达量上调。Gm CHS1a在体壁和头部的表达量高于Gm CHS1b,而在气管和脂肪体中的表达量略低于Gm CHS1b,两者在中肠和马氏管中表达量都很低。在梨小食心虫不同发育阶段,Gm CHS1a的表达趋势表现为在幼虫蜕皮和预蛹-蛹转变过程中高表达;Gm CHS1b在幼虫各个阶段表达量都较低,在预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中高表达。【结论】Gm CHS1a和Gm CHS1b属于昆虫几丁质合成酶1家族,其基因在梨小食心虫不同组织及发育阶段的表达量显著不同,推测其在梨小食心虫发育过程中发挥着不同的作用。本研究为进一步探索该基因在梨小食心虫体内的功能奠定了基础。     

蜕皮激素和有效霉素对粘虫几丁质合成酶B基因表达的影响

【目的】克隆粘虫Mythimnaseparata几丁质合成酶B基因的全长cDNA序列,研究该基因的时空表达特性,分析蜕皮激素(20-hydroxy ecdysone, 20 E)和有效霉素(Validamycin)对该基因表达水平的影响。【方法】本试验通过高通量测序法获得粘虫几丁质合成酶B基因的cDNA全长序列,利用RT-qPCR技术分析粘虫几丁质合成酶B基因在不同发育阶段和不同组织的特异性表达及蜕皮激素和有效霉素对其表达的影响。【结果】基因cDNA全长4 617 bp,包含一个完整开放阅读框,编码1个1 538个氨基酸组成的多肽,分子量为175.629 ku,理论等电点为5.96,包含17个跨膜螺旋,4个几丁质合成酶的标签序列CATMWHET,DGD,EDR和QRRRW及1个催化结构域。该基因命名为MsCHSB,GenBank登录号为KY348776。氨基酸序列比对表明,该基因与其他昆虫的几丁质合成酶B基因同源性高于52%,其中与蓓带夜蛾Mamestra configurata和棉铃虫Helicoverpa armigera的几丁质合成酶B基因同源性最高,分别为92%和83%。RT-qPCR技术表明粘虫在不同发育阶段和组织中均有mRNA的特异性表达,其中3龄第1天和中肠中MsCHSB基因相对表达量最高。注射10μg/μL浓度的蜕皮激素6 h和12 h后,表现为对该基因的诱导效应,与对照组差异显著;有效霉素处理后该基因相对表达量均被显著抑制,其中注射20μg/μL浓度的有效霉素48h后,抑制作用最为明显。【结论】本试验得到了一条新的粘虫几丁质合成酶B基因cDNA序列全长。蜕皮激素对MsCHSB基因的表达有一定的诱导作用,有效霉素对MsCHSB基因的表达有一定的抑制作用,该结果为进一步研究昆虫几丁质合成酶B打下了基础。