1,3-丙二醇发酵过程中乳酸抑制的研究

目的:研究乳酸对克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia)产1,3-丙二醇的影响。方法:通过在摇瓶和反应器水平下分析不同菌株(包含无乳酸、2,3-丁二醇产生的基因敲除菌)的乳酸代谢特性。结果:前期添加6 g/L的乳酸使1,3-丙二醇的产量降低了19%,而发酵10h后添加乳酸几乎不表现出抑制作用。通过对乳酸敲除菌株的代谢分析发现,发酵后期能够消耗培养基中的乳酸,这在一定程度上也反映了菌体发酵后期对乳酸的耐受性。结论:乳酸的抑制作用主要发生在1,3-丙二醇发酵的前期。解除了一株无副产物2,3-丁二醇生产株前期乳酸的过早积累后,1,3-丙二醇的的产量提高了56%。     

产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。     

pH对克雷伯氏菌1,3-丙二醇合成关键酶酶活及发酵特性的影响

在5 L发酵罐进行甘油脉冲流加发酵,分析了不同pH值对克雷伯氏肺炎杆菌发酵特性的影响,pH 6.5为菌体最佳生长条件,克雷伯氏肺炎杆菌合成1,3-丙二醇的产量最高。在1,3-丙二醇合成速率较大的对数中前期,进行甘油脉冲流加发酵,提高甘油浓度促进甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶活性。不同pH值的脉冲试验表明,甘油脱水酶,2,3-丁二醇脱氢酶比酶活随着pH值的升高而升高,1,3-丙二醇氧化还原酶,乳酸脱氢酶比酶活在pH6.5最高,因此偏酸性的发酵条件和对数期维持一定的甘油浓度能够促进1,3-丙二醇的合成。     

丁酸梭杆菌发酵甘油制备1,3-丙二醇的研究

本研究采用丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)从甘油发酵制备1,3—丙二醇。该发酵需厌氧培养,发酵培养基为：甘油6％,葡萄糖1％,玉米浆2％,(NH4)2SO40．2％。发酵温度为34℃,pH为6．5～7。在最佳条件下,发酵50h可产1,3—丙二醇40．7g／L,甘油摩尔转化率达68％。     

丙酮酸对肺炎克雷伯氏菌微氧发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

微氧条件下,考察肺炎克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中柠檬酸和丙酮酸对发酵过程的影响。摇瓶实验结果表明:添加柠檬酸能抑制菌体生长和1,3-丙二醇合成;丙酮酸对菌体生长和1,3-丙二醇合成有一定的促进作用。5 L发酵罐批式发酵表明:补料培养基中加入8 g/L丙酮酸,1,3-丙二醇的产量提高了约10.8%,转化率提高了约4.4%,比生长速率提高了约10.8%。上述结果初步表明,强化能量的产生能够有效促进1,3-丙二醇的合成,可以利用分子生物学手段强化丙酮酸的产生以促进1,3-丙二醇的合成。     

提高肺炎克雷伯氏菌产1,3-丙二醇的分子生物学方法研究进展

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)可用于工业合成多种化合物,包括聚酯、聚醚和聚氨酯。发酵法生产1,3-PD具有巨大潜力。本文从代谢途径分析入手,梳理了肺炎克雷伯氏菌厌氧代谢途径的相关酶及催化作用,较详细地综述了其产1,3-PD关键酶的分子改造、基因工程菌株的构建和关键酶基因表达、副产物相关代谢酶基因敲除等方面的最新进展,并展望了其今后的发展前景。     

罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001培养方法优化及改善睡眠功能研究

为了优化罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001的培养方法,并探究其助睡眠功能,以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的产量为考察指标,通过单因素实验、响应面实验和小鼠实验进行条件筛选和功能评价。在培养温度37℃,培养时间24 h,初始pH 6.5时,罗伊氏粘液乳杆菌的GABA产量为5.58 g·L^-1。直接睡眠实验中小鼠均未出现直接睡眠现象,延长戊巴比妥钠催眠小鼠的睡眠时间实验中,高剂量组的小鼠睡眠时间有效延长,戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验结果显示高剂量组的小鼠入睡率高达40%,巴比妥那睡眠潜伏期实验显示高剂量组的小鼠减少了睡眠潜伏期,可与巴比妥钠协同发挥作用。结果表明罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001具备助睡眠的作用。     

聚羟基丁酸路径在克雷伯氏菌中的构建

以生物柴油的副产物甘油生产高附加值的1,3-丙二醇,现已成为提升生物柴油产业链经济性的重要途径,而中间代谢产物3-羟基丙醛积累造成细胞死亡,发酵异常终止是生物法生产1,3-丙二醇过程中的关键问题。不同于传统的降低3-羟基丙醛积累的思路,本文从增强克雷伯氏菌对3-羟基丙醛的抗逆性出发,改善克雷伯氏菌1,3-丙二醇的生产性能,首次将聚羟基丁酸路径引入克雷伯氏菌中,构建了新型基因工程菌,并对其1,3-丙二醇发酵性能及聚羟基丁酸代谢进行了初步的研究。经IPTG诱导,工程菌中检测到聚羟基丁酸,其含量随IPTG浓度增加而增大。优化的IPTG浓度为0.5 mmol/L。初始甘油50 g/L时,野生菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,1,3-丙二醇浓度达到22.1 g/L,其质量得率为46.4%。当初始甘油达到70 g/L时,由于高浓度3-HPA积累,野生菌发酵终止,而工程菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,PDO产量可达31.3 g/L,其质量得率为43.9%。同时检测到聚羟基丁酸积累。研究结果有助于加深对克雷伯氏菌1,3-丙二醇代谢机理的认识,为克雷伯氏菌的进一步优化提供了新的思路。     

产1，3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB—tac—yqhD）的构建

在生物柴油的生产过程中,最高可得到约10％的副产物甘油,副产物甘油的去向将成为生物柴油大规模产业化发展所面临的严峻问题。以生物柴油副产物甘油为原料耦合生产1,3-丙二醇,不仅解决了生物柴油副产物甘油的出路问题,同时降低了1,3-丙二醇的生产成本。本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏茵的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用表达载体pEtac串联构建了重组质粒pEtac—dhaB—tac—yqhD,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB-tac—yqhD）,降低了代谢中间产物3-羟基丙醛的积累,提高了1,3-丙二醇的产量。     

产1,3-丙二醇菌株的诱变和筛选

为提高克雷伯氏肺炎杆菌产1,3-丙二醇的能力,以离子束、紫外线和氯化锂为复合诱变法,建立了产酸圈和产物耐受相结合的平板筛选方法,获得可耐受高浓度1,3-丙二醇并且副产物中乙醇含量较少的优良突变菌株2株。与出发菌株相比,两株高产突变菌株Klebsiella pneumoniae LM 03和Klebsiella pneumoniae LM05的1,3-丙二醇产量分别提高了33% 和30% ,达到66.74 g/L和65.12 g/L;乙醇产量分别降低了38% 和24% ,降低为6.59 g/L和8.05 g/L。同时测定了诱变前后还原途径中甘油脱水酶（GDHt）和1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）的酶活变化,研究表明诱变对GDHt有明显的促进作用,而对PDOR的影响不明显。该诱变和筛选方法目标明确、易操作、效率高,在1,3-PD工业规模的生物法生产中将具有良好的应用价值,而且对于其他具有工业应用价值的菌株筛选工作也具有一定的借鉴意义。     

Rib类似蛋白在三种乳酸杆菌中的分布

【目的】阐明罗伊氏乳杆菌中Rib蛋白在细菌中的亚细胞定位,以及其在几种乳酸杆菌中的分布,探讨Rib蛋白潜在的生物学功能。【方法】以罗伊氏乳杆菌ATCC55730中Rib蛋白的基因为模板,设计特异性引物,通过PCR获得Rib蛋白N末端非重复区序列并在大肠杆菌中进行异源表达,经过亲和层析和分子筛获得纯化的Rib蛋白,制备Rib蛋白的小鼠多克隆抗体。通过蛋白质免疫印迹方法对11株乳酸杆菌中Rib类似蛋白进行检测。【结果】Western blot结果显示Rib蛋白主要分布于罗伊氏乳杆菌的细胞壁上。PCR和Western blot均表明Rib类似蛋白在4株罗伊氏乳杆菌、6株植物乳杆菌和1株干酪乳杆菌中均可被检测到。【结论】Rib类似蛋白可能在乳酸杆菌中分布较广泛,它们主要存在于细菌细胞壁上的现象表明其可能对这些乳杆菌在宿主肠道的定殖具有一定作用。     

香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌在无菌猪肠道中的定殖

【背景】已有研究表明,微生物在宿主肠道中的定殖受宿主、肠道环境、微生物物种特性和菌株来源等多个因素的影响。一般认为,来源于同类宿主的微生物菌株,在该类宿主肠道中具有定殖优势,但缺乏在物种和菌株水平上研究微生物自身特性在宿主肠道中定殖的研究报道。【目的】将不同来源(同类宿主肠道、非同类宿主肠道和非肠道环境)、具有不同生物学特性的3株香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)和4株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)对无菌猪肠道进行定殖,在物种和菌株2个水平上探究物种特性和菌株来源对宿主肠道定殖的偏好性,揭示影响微生物定殖效率的关键因素。【方法】在本项研究中,将从藏猪(Tibetan pigs)、小鼠(ob/ob mice)、食蟹猴(Macaca fascicularis)和发酵食品中分离得到的多株香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌,制成混合菌剂对无菌巴马香猪(Bama miniature pig)进行为期4周的饲喂,并通过实时荧光定量PCR方法检测这7株菌在无菌猪肠道中的定殖情况。【结果】在物种水平上,香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌在无菌猪体内具有相近的定殖细胞数目。但是在菌株水平上,小鼠来源的香坊肠球菌(EX-MS)和罗伊氏乳杆菌(LR-MS)定殖的细胞数目显著高于其他5株菌,表明小鼠来源的菌株具有定殖优势。在体外混合培养中,将3株香坊肠球菌和4株罗伊氏乳杆菌分别等比例混合培养72 h后,发现香坊肠球菌EX-MS菌株的细胞数目高于香坊肠球菌EX-MK和EX-PG菌株;在罗伊氏乳杆菌中,4株菌的细胞数目相近。7株菌相互作用表明,EX-MS菌株对EX-MK和EX-PG菌株均有明显的抑制作用,但对4株罗伊氏乳杆菌无抑制作用。【结论】本次定殖实验的结果表明,在物种水平上,香坊肠球菌和罗伊氏乳杆菌均具有在无菌猪肠道中良好的定殖能力;但在菌株水平上,小鼠来源的香坊肠球菌EX-MS菌株和罗伊氏乳杆菌LR-MS菌株具有定殖优势;同时发现,小鼠来源的香坊肠球菌EX-MS菌株通过抑制同物种的EX-PG和EX-MK菌株,获得了在宿主肠道中的定殖优势。     

利用克雷伯肺炎杆菌限制性底物发酵生产1，3-丙二醇

研究了克雷伯肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）批式流加发酵生产1,3-丙二醇的发酵工艺,根据1,3-丙二醇的生产和菌体生长相关的特点,采用营养基质限制性流加的发酵工艺,通过控制氮源氯化铵以保持细胞稳定生长。结果表明：过低的氮源浓度,细胞生长受到限制,影响产物1,3-PD的合成;过高的氮源浓度,细胞比生长速率增加,但1,3-PD关于消耗甘油的得率降低,用于生长和维持代谢所消耗的甘油量增加。以0.41 g/(L·h)的氮源流加速率,残余氯化铵浓度在0.1 g/L时,转化率和生产强度最高。发酵25 h～28 h后,1,3-丙二醇最终浓度达到52.03 g/L,生产强度为2.04 g/(L·h),相对于甘油的摩尔转化率为0.66,分别比氮源限制前提高了28.0 ％、35.1 ％及29.4 ％。通过限制性流加氯化铵,控制细胞的比生长速率,使底物甘油有效转变为发酵的目标产物1,3-PD,有效实现产物1,3-PD的高生产强度以及对甘油的高转化率。     

2,3-丁二醇代谢途径关键酶基因敲除对克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的影响

2,3-丁二醇是克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的主要副产物,为减少2,3-丁二醇的产生,利用Red重组技术对克雷伯氏菌2,3-丁二醇合成途径关键酶基因budC和budA进行了敲除。突变株发酵性能实验结果表明,所获得的两株突变株生长性能受到不同程度的影响;budC基因的缺失使菌株1,3-丙二醇产量提高了10%,2,3-丁二醇降低为原来的70%,而budA基因缺失则使菌株无2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产生,但乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的产量较出发菌株都有明显增长。通过进一步对budC基因缺失菌株主要产物分析,推测在该菌中存在2,3-丁二醇回补途径,这一结果为低副产物克雷伯氏菌的改造提供了新依据。     

克雷伯氏肺炎杆菌LDH526产1,3-丙二醇的甘油自动流加策略

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,主要作为平台化合物用于合成聚酯,如聚对苯二甲酸丙二醇酯。经基因工程改造的克雷伯氏肺炎杆菌LDH526能以甘油作为唯一碳源合成1,3-丙二醇,最终发酵浓度超过90 g/L。甘油浓度是影响1,3-丙二醇合成的关键因素。为了实现对甘油浓度的精确控制,设计并优化了基于发酵动力学的甘油自动流加策略。通过将底物流加速率与易观察变量p H和发酵时间偶联,实现了发酵过程中甘油流加的自启动和甘油浓度的动态控制。发酵72 h,1,3-丙二醇的浓度可稳定超过95 g/L。自动控制甘油流加的发酵过程具有可重复性、连续性以及人工工作量少的特点,有望从实验室规模扩大到生产规模。     

罗伊乳杆菌对致龋变形链球菌拮抗作用的研究

目的研究罗伊乳杆菌对变形链球菌的拮抗作用,初步了解产生拮抗作用的原因。方法利用罗伊乳杆菌无菌上清液,应用双层平板打孔法测定其抑菌效果,再通过滤纸片抑菌法对罗伊乳杆菌发酵的酸乳制品与普通酸乳制品对变形链球菌的抑菌作用进行比较,用饱和硫酸铵沉淀法分析产生拮抗作用的原因。结果罗伊乳杆菌有显著抑菌活性（P〈0.05）,仅罗伊乳杆菌的发酵乳样品对变性链球菌产生直径为6.3mm抑菌圈,80%饱和硫酸铵沉淀的细菌素抑菌活力最强,蛋白酶K处理后无明显抑菌圈。结论本研究证明了罗伊乳杆菌的代谢产物以及罗伊乳杆菌发酵的酸奶制品对致龋菌变形链球菌有着明显的拮抗作用。     

高黏附罗伊氏乳杆菌的筛选及其益生特性评价

通过对28株不同罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株的粘附力、细胞表面疏水性、与大肠杆菌的共聚合等指标的测定及相关性分析,成功筛选出粘附力最高的菌株R28。研究了该菌株的耐酸性和耐胆盐能力。结果表明,R28与其它菌株相比具有良好的粘附能力。该菌株的自聚集能力和疏水性分别为26.25%和75.53%。与大肠杆菌的共聚合能力可高达36.84%。细胞粘附数可达约43个细菌/每个杆菌细胞。菌株R28具有良好的耐酸性(pH=3)和耐胆盐性(0.1%),其能够很好的粘附于宿主肠道细胞发挥益生作用。罗伊氏乳杆菌R28作为一株优良的益生菌在食品和医药领域具有广阔的应用前景。     

产1,3-丙二醇菌株丁酸梭菌的诱变育种

甘油由丁酸梭菌转化成1,3-丙二醇的研究是厌氧条件下进行。为了获得1,3-丙二醇的高产突变株,以丁酸梭菌为出发菌株进行诱变处理。经过硫酸二乙酯（DES）化学诱变得到2株高产正突变株C.but2031和C.but2046,再经过紫外线和亚硝基胍（NTG）复合诱变得到突变株C.but3037。经过初筛、复筛和传代实验,表明其是稳定的突变株。C.but3037的1,3-丙二醇产量由出发菌株的2.2g/L提高到15.7g/L,提高了6.13倍,     

异源表达木糖异构酶基因对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

【目的】提高克雷伯氏菌胞内还原力以强化1,3-丙二醇合成。【方法】将来源于大肠杆菌的木糖异构酶基因在克雷伯氏菌中异源表达,构建重组菌。研究重组菌添加不同浓度木糖为辅底物与甘油共发酵过程中代谢产物和NADH的变化规律。【结果】与对照菌相比,重组菌细胞内还原力NADH提高了0.1?0.3倍,1,3-丙二醇产量达到23.31 g/L,提高20%,1,3-丙二醇转化率从0.60 mol/mol提高到0.73 mol/mol。【结论】木糖异构酶基因的表达强化了木糖代谢途径,经磷酸戊糖途径积累大量还原力,促进了1,3-丙二醇的生成。     

应用数学统计法优化副干酪乳杆菌HDl.7固定化细胞制备和产细菌素发酵

[目的]应用数学统计法对副干酪乳杆菌HD1.7的固定细胞制备和发酵条件进行优化,以提高细菌素产量.[方法]用2(6-2)部分因子分析法筛选对细菌素产量影响显著的因子,发现海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间对细菌素的产生影响显著.利用最陡爬坡法逼近最大响应区域.用Box-Behnken设计确定最佳海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间,并进行分批重复发酵.[结果]固定化生产细菌素的最佳条件是海藻酸钠浓度2.8%、CaC2,浓度5%、固定化时间4 h、菌体包埋量1/20、发酵时间63 h和固定化细胞的接种量8.2%,在此基础上用固定化细胞进行分批重复发酵,每批细菌素的发酵周期为24 h.[结论]通过对固定化细胞制备和发酵条件的优化,固定化细胞在327 h的分批重复发酵中细菌素的总体产量比游离细胞提高了19%,发酵液中无明显细胞渗漏现象且实现了细胞的重复利用,为细菌素的进一步研究和最终提取奠定了基础.