G_β类似蛋白─WDR26对细胞增殖的影响

WD40重复序列蛋白是一类结构保守、功能复杂的蛋白.关于此类蛋白和细胞内信号传导途径的研究显示,该家族成员很可能通过调控胞内信号转导而影响细胞基本生命活动.在此前的研究中,我们报道了一个新基因WD40repeatprotein26的克隆.其初步研究结果显示WDR26蛋白与MAPK信号途径的负调控相关.在最近的研究中,我们构建了稳定转染pCMV-WDR26表达载体的HeLa细胞系,结果显示WDR26蛋白在HeLa细胞系中的过度表达,能够促进细胞分裂,加快细胞的倍增速度.因此,WDR26很可能具有通过MAPK信号途径调节细胞增殖的功能.     

人类新基因WDR24的研究初报

WD40家族是一类结构保守、功能复杂的蛋白.目前很多研究显示该家族成员通过参与MAPK信号途径调控细胞内信号转导而影响细胞的基本生命活动.为了鉴定参与细胞生命活动的新基因,运用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得一个新的人类基因WDR24, 其cDNA全长3 302 bp,2 373 bp长的开放阅读框编码由790个氨基酸残基组成的蛋白质.生物信息学分析表明,WDR24蛋白在进化上高度保守,与其他脊椎动物中的同源蛋白组成了一个功能未知的亚家族.蛋白序列分析显示其中有6个WD40重复序列和1个ERK的停泊位点D-domain.RT-PCR分析表明,该基因在所有被检测的人类胚胎组织中表达.     

WDR蛋白在肿瘤发生发展中的作用机制

WDR蛋白家族(Trp-asp repeat protein family)是含有多个保守WD基序(WD motif)的蛋白质类,广泛存在于真核生物中。近年,WDR蛋白的研究已成为细胞生物学和病理学研究的新热点。目前已知多种WDR蛋白在肿瘤细胞中异常表达,并通过调节信号转导、细胞周期、泛素化、转录和RNA加工等生物过程促使肿瘤发生。现对WDR蛋白在肿瘤发生发展中的作用机制作一综述。     

丝裂原活化蛋白激酶4通过激活AKT促进宫颈癌细胞增殖

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族在基因表达调控和细胞功能活动中发挥了关键作用,并且在肿瘤的发生发展中也起着重要作用。最近发现,MAPK家族的一个新成员MAPK4在肺癌的进展中起着重要作用,然而MAPK4在宫颈癌中的作用尚未见报道。本研究首先通过GSCA在线软件在12个组织类型共65种肿瘤细胞系中分析了MAPK4的mRNA水平。根据分析的结果,选取了宫颈癌细胞中MAPK4表达最高的HeLa细胞和表达最低的SiHa细胞作为研究模型进行下一步的研究。在HeLa细胞中,干扰MAPK4的表达后,通过CCK8试验检测了宫颈癌细胞的增殖能力,发现HeLa细胞的增殖能力显著下降。在SiHa细胞中,转染MAPK4过表达质粒后检测细胞的增殖能力,发现MAPK4过表达后,SiHa细胞的增殖能力显著上升。最后,本研究探索了MAPK4诱导宫颈癌细胞增殖的分子机制,发现在宫颈癌细胞中MAPK4促进了蛋白激酶B(AKT)的活性,这表明MAPK4可能通过激活AKT促进了宫颈癌细胞的增殖。上述研究结果表明,MAPK4能作为判断宫颈癌增殖潜能的标志物以及宫颈癌治疗的潜在分子靶点。本研究为宫颈癌的发病机制提供了新的见解,对开发新的靶向药物治疗宫颈癌具有一定的价值。     

一个莱茵衣藻WD40蛋白正向调控油脂的积累

WD40蛋白(WD40-repeats)一般存在于真核生物中,具有广泛的生理生化功能。本研究以莱茵衣藻一个WD40(Cre12.g552900)蛋白为研究对象,通过遗传转化的方法实现对该基因的敲除和过量表达。转基因藻株检测结果显示Cr WD40 RNAi转基因藻株油脂含量减少了11%~24%,而Cr WD40过量表达转基因藻株油脂含量增加了14.3%~75%,正反两方面实验说明Cr WD40对油脂积累起到正向调控的作用。     

HeLa细胞中缝隙连接蛋白Cx26/Cx32的表达及其功能调控

目的 在HeLa宫颈癌细胞中研究不同浓度的多西环素对缝隙连接蛋白Cx26/Cx32表达及由其形成的缝隙连接通讯功能的影响.方法 采用Western印迹检测HeLa细胞中Cx26/Cx32的蛋白表达;荧光示踪实验用于检测HeLa细胞中由Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能.结果 Western印迹结果显示多西环素在0.01～1 μg/ml的范围内,随着剂量的增加,Cx26/Cx32蛋白表达水平增加;荧光示踪实验结果显示HeLa细胞之间的荧光传递随着多西环素增加也相应增强.结论 采用加入不同浓度多西环素的方法,可制备缝隙连接通讯功能强弱不同的细胞模型.     

LINC00665通过激活WNT-CTNNB1/β-catenin信号通路促进HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（英文）

越来越多的证据表明,长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在癌症进展中起关键作用。但是,人们对lncRNA 00665 (LINC00665)在大多数癌症中的作用了解甚少。本研究旨在揭示LINC00665在宫颈癌细胞中的功能。用小发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)敲减HeLa细胞中LINC00665的表达以研究宫颈癌细胞在体外和体内的转移和增殖表型。将LINC00665敲减组和对照组HeLa细胞进行转录组测序,筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。对DEGs进行Metascape数据库功能分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)。用Western blot和免疫荧光染色法检测WNT-CTNNB1/β-catenin通路和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标记物的表达水平。结果显示,沉默LINC00665降低HeLa细胞活力,上调E-cadherin蛋白表达水平,下调N-cadherin、Vimentin和CTNNB1蛋白表达水平,抑制HeLa细胞的迁移和侵袭。生物信息学分析结果显示LINC00665可能通过激活WNT-CTNNB1/β-catenin信号转导通路促进EMT。以上结果提示,LINC00665通过WNT-CTNNB1/β-catenin信号传导途径调控HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。LINC00665可能作为一个潜在的宫颈癌药物治疗靶点。     

WDR91-WDR81复合体调控内吞体-溶酶体运输及神经发育

WD40重复序列蛋白在真核生物中广泛存在,并参与胞内运输、信号转导、凋亡发生、转录调控等生命过程.通过以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模式动物进行遗传筛选,本课题组发现了两个新基因,其人类同源基因编码WD40重复序列蛋白WDR91和WDR81,然而此前对这两种蛋白的功能知之甚少.本课题组后续工作发现, WDR91和WDR81形成复合体,作为晚期内吞体的特征性小GTP酶Rab7的效应因子被招募到内吞体上,与Ⅲ型磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合体的Beclin 1亚基相互作用,抑制内吞体上磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns3P)的合成,使早期内吞体向晚期内吞体转化,从而确保内吞体-溶酶体运输得以实现. WDR91-WDR81复合体与神经发育紧密相关,具体表现在特异性敲除WDR91的小鼠神经突起生长受损,而WDR81通过内吞体SARA-TGFβ信号通路影响成体神经发生.此外, WDR81还可作为衔接蛋白结合p62和LC3C,以不依赖于WDR91-WDR81复合体的形式促进蛋白聚集体的选择性自噬.这些发现为揭示WDR91和WDR81相关的神经系统疾病致病机制提供了重要理论依据.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在异源细胞中的表达研究

本研究构建了一系列乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的表达载体,其中HBsAg基因的启动区被小鼠金属硫蛋白启动子取代;而对HBsAg基因下游非编码区的几种基因元件则进行了不同的删除,并且添加异源基因调控元件。利用Hela细胞瞬时表达系统对各种构建物的表达水平进行分析。实验发现：除了必须取代HBsAg基因原有的启动子外,乙型肝炎病毒(HBv)增强子Ⅰ及其多聚腺苷酸化(poly A)信号对HBsAg在非肝脏细胞中表达也至关重要。但HBsAg的poIy A信号可用异源的poly A信号及猴空泡病毒(sV 40)T抗原基因的剪接信号取代。在HeLa细胞表达系统中,这种取代可进一步提高HBsAg的表达水平。反之,HBV增强子Ⅱ在HeLa细胞中对HBsAg基因的表达无显著作用。实验结果提示：除了已报道的HBV增强子Ⅰ能激活基因本身的启动子外,很可能还存在另外的功能,即对HBsAg转录体起稳定作用。     

果蝇新基因CG7609的克隆与初步功能研究

通过生物信息学方法和分子克隆技术克隆了一个果蝇新基因CG7609．该基因属于WD40家族,具有7个典型的WD40重复结构域．与人类WDR24基因的同源度很高．胚胎原位杂交和RT-PCR显示其在胚胎早期的中胚层有弱表达,在胚胎晚期主要在肠中表达．通过心脏特异抗体检测CG7609突变体的表型,发现其心脏前体细胞的分化不受影响．但通过果蝇心力衰竭模型分析该基因在成体心脏中的功能,发现CG7609基因缺失后心力衰竭发生率明显高于野生型,而且在与pannier基因配对后心力衰竭率发生较大的变化,这个初步发现推测该基因可能在戍体心脏中具有功能．     

趋化因子CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性表型的影响及机制

目的研究趋化因子CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性表型的影响及其机制。方法通过基因转染构建过表达趋化因子CXCL5的宫颈癌HeLa细胞株,研究过表达CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性行为和肿瘤相关基因表达的影响。结果 CCK-8、集落形成和划痕实验结果显示,过表达CXCL5可明显促进HeLa细胞的增殖和迁移能力;Western Blot实验结果表明,与空载体转染细胞株相比较,CXCL5过表达HeLa细胞株的ERK和p-ERK蛋白表达水平显著提高。结论趋化因子CXCL5通过ERK信号通路经自分泌途径促进宫颈癌细胞的增殖与迁移。     

miR-30d负性调节HeLa细胞的增殖

有证据显示,microRNA( miRNA)可作为癌基因或抑癌基因发挥功能,参与细胞增殖和凋等 调控;PI3K/Akt通路的持续活化与肿瘤的发生、发展密切相关．在本研究中,我们通过microarray技术在HeLa细胞中检测经ly294002作用24 h阻断PI3K/Akt通路后microRNA的表达变化．Taqman 实时 PCR实验结果显示,has-miR-30d的表达在PI3K/Akt通路被阻断后明显上调．萤光素酶报告基因转染结合Taqman 实时 PCR显示,稳定转染miR- 30d过表达质粒的HeLa细胞系中miR-30d的表达量升高并且有活性．MTT及流式细胞术分析显示,过表达miR-30d的HeLa细胞其增殖受到抑制．这些结果说明,has-miR-30d可抑制HeLa细胞增殖,负性调节细胞生长,是一个潜在的抑癌基因．     

T细胞受体(TCR)信号传递的调控及其功能

T细胞受体介导的T细胞活化在胸腺T细胞发育、T细胞亚群分化以及效应T细胞功能发挥过程中均起着至关重要的作用。TCR能特异性识别抗原提呈细胞表面MHC提呈的抗原肽(peptide),并将胞外识别转化成可向细胞内部传递的信号,通过诱导TCR邻近酪氨酸激酶活化,促进信号传递复合物组装,活化下游MAPK、PKC以及钙离子等信号途径,最终活化相应的转录因子,调控效应蛋白分子的表达,完成T细胞的活化。TCR信号传递过程受到不同类型调控分子的调控,这些具有调控功能的分子形成了一个复杂的调控网络来精细调控TCR信号的起始、强度及终止。     

低剂量顺铂通过p38MAPK介导的DNMT1下调降低p21与p16启动子甲基化上调p21与p16表达

低剂量顺铂可通过诱导p21与p16表达而诱导肿瘤细胞早衰,但其机制不明。本研究探讨了低剂量顺铂诱导的HeLa细胞衰老过程中p21与p16的上调机制。低剂量顺铂（4 μmol/L）处理HeLa细胞后,DNA甲基转移酶DNMT1蛋白水平降低;p21与p16启动子甲基化水平降低,二者mRNA及蛋白质水平升高;顺铂对DNMT1蛋白水平的降低作用与其激活p38MAPK有关,用SB203580抑制p38MAPK可部分逆转顺铂对DNMT1蛋白水平以及p21与p16启动子甲基化的降低作用,从而部分逆转顺铂对p21与p16表达的诱导;抑制p38MAPK 也可部分逆转低剂量顺铂诱导的HeLa细胞早衰。上述结果表明,低剂量顺铂可通过p38MAPK信号通路下调p21与p16启动子甲基化水平,进而上调二者的表达。这些结果为解析低剂量顺铂诱导肿瘤细胞早衰的信号转导机制提供了实验依据。     

血清抑制基因Si1编码蛋白的亚细胞定位研究

为进一步研究血清抑制相关基因(Si1)的生物学功能,用绿色荧光蛋白EGFP融合的EGFP/Si1重组蛋白在HeLa细胞中成功表达．结果显示该蛋白定位在细胞核中,这一结果与生物信息学预测结果相符合．通过构建不同长度的EGFP/Si1基因突变体观察其核定位信号所在区段,发现核定位信号区在465～531氨基酸残基之间．Si1基因编码框中肿瘤相关1 639位点的改变,虽然并不在入核信号相关结构区,但影响Si1基因表达蛋白的细胞核迁移,进而影响基因功能．     

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.     

小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

RMNDSA通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.通过PCR扩增RMND5A基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过IPTG进行诱导表达GST-RMND5A融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果说明,获得了RMND5A原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗RMND5A多克隆抗体,为RMND5A进一步的功能研究奠定了基础.     

hLBH的转录活性及其在MAPK信号转导途径中的作用

hLBH是一个人类心脏发育相关的候选基因,研究了hLBH的转录活性及其在MAPK信号途径中的作用.荧光素酶检测实验表明hLBH是一个转录激活因子.基因结构分段实验证明hLBH的两个模体在调节转录激活中起着重要的作用.将hLBH蛋白分别与SRE和AP-1共转染之后激活了SRE和AP-1的活性.这些结果表明hLBH可能通过MAPK信号途径来介导细胞功能.     

转录因子GGS1参与赤霉素和糖信号调控

MYB类转录因子GGS1（glucose and GA signaling 1）既受到DELLA蛋白的调控,又与糖受体蛋白HXK1形成核内复合体.前人的这些研究结果暗示,GGS1可能同时参与了赤霉素和糖的信号调控.为了进一步证实GGS1基因在两信号途径中发挥的作用,我们对以下两个方面进行了研究.首先对GGS1基因表达谱进行分析,结果表明,GGS1特异在拟南芥各器官的维管组织的韧皮部细胞中表达;用赤霉素和高浓度蔗糖处理能抑制GGS1基因的表达.GGS1同源基因虽和GGS1具有相似的表达谱,但是其表达却不受GA和糖处理的影响,暗示二者间不存在功能冗余.其次,我们获得GGS1过表达转基因植株并通过Q-PCR分析这一植株中GA和糖代谢途径中一些重要相关基因表达变化.结果表明,在GGS1过表达植株中参与GA合成的基因表达升高,GA分解代谢基因表达降低;与糖信号密切相关的光合作用相关基因表达升高.两方面研究结果证实了GGS1的双元功能,即既可以作为GA信号调控的负调控因子,又在糖的信号传递中发挥作用.