8-氯腺苷诱导的组蛋白H3K79双甲基化促进NBS1和p21的基因转录激活

组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化（H3K79me）修饰有单甲基、双甲基及三甲基3种形式,是常染色质的标志.然而,对于组蛋白H3K79三种甲基化各自在基因转录、DNA损伤修复中所起的作用尚不十分清楚.本研究以8-氯腺苷（8-Cl-Ado）为DNA双链断裂（DNA double-stranded breaks,DSB）诱导剂,采用Western 印迹,在人肺癌细胞H1299检测出了DNA修复分子NBS1、细胞周期检验点相关分子p21,并发现H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3三种甲基化修饰的组蛋白明显增加;染色质免疫共沉淀结合实时定量PCR实验显示,只H3K79me2与DNA损伤检验点分子p21、DNA修复分子NBS1的启动子区域相结合,说明H3K79双甲基化修饰与这些基因的转录激活有关.结果提示,在8-氯腺苷引起 DSB时,是H3K79me2、而不是H3K79me1和H3K79me3参与NBS1和p21基因转录激活时的染色质重塑.8-氯腺苷诱导H3K79双甲基化增强、促进H3K79me2所在染色质区域的NBS1和p21基因转录激活可能是8-Cl-Ado抑制肿瘤细胞生长作用机制之一.     

氨肽酶N的表达及其与结石形成的关系(英文)

 为研究大鼠高胆固醇饮食时 ,肝脏氨肽酶N(APN)在实验结石形成中可能的结石发生作用 ,采用 1.2 %胆固醇饮食 4周 ,诱发新西兰兔胆囊结石形成 .根据兔APN基因cDNA序列设计引物 ,提取肝脏总RNA .利用RT PCR检测肝脏APNmRNA水平的变化 ,用组织化学方法观察肝脏毛细胆管膜上APN的表达 .观察新西兰兔胆囊结石形成过程中肝脏APN的mRNA水平的变化、APN表达及胆汁中APN活性、胆脂、总蛋白含量的变化 ,探讨APN在胆石形成中可能的作用 .经成石饲料饲养后 ,随着胆汁饱和度增加和APN活性加强 ,胆囊结石组肝脏APNmRNA水平较对照组明显增高 ,胆囊结石组胆汁中总胆固醇、CSI、总蛋白浓度及APN活性均明显高于对照组 ,且胆汁中APN活性与肝脏APN的表达及胆汁CSI增高呈正相关 .结果提示 ,当存在胆汁过饱和的情况下 ,APN很可能作为促成核因子在胆结石形成早期发挥重要作用     

降钙素基因相关肽对血管内膜损伤后内皮细胞功能恢复的 …

在球囊剥脱大鼠主动脉内膜造成的内皮损伤模型上,用ＣＧＲＰ治疗后观察血管内皮合成释放ｖＷＦ含量及ｔ－ＰＡ活性的变化。结果表明ＣＧＲＰ能明显降低ｖＷＦ含量ｔ－ＰＡ活性。提示ＣＧＲＰ能三轻内皮损伤反应,在促内皮细胞增殖的同时对内皮某些功能恢复亦有一定的作用。     

八氯腺苷诱导SH-SY5Y和SK-N-SH细胞G2/M期阻滞的分子机制不同

为探索八氯腺苷的抗肿瘤作用机制,以神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-SH细胞为对象,采用四唑盐比色实验（MTT法）证明,八氯腺苷具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用呈剂量-时间依赖性.流式细胞分析显示,10 μmol/L八氯腺苷作用48 h后可导致靶细胞生长停滞于G ^₂/M期;SH-SY5Y细胞发生明显细胞凋亡,但SK-N-SH细胞却未见凋亡.Hoechst 33342染色显示,SK-N-SH细胞发生了核分裂异常.蛋白质免疫印迹分析证明,10 μmol/L 八氯腺苷处理SH SY5Y 48～72 h后,G^₂检验点调节蛋白ATM、Chk1、Cdc25C和Cdc2磷酸化形式明显上调,同时伴有caspase-3的激活,提示SH-SY5Y细胞发生了G^₂检验点通路和细胞凋亡途径的激活.与SH-SY5Y细胞不同,在SK-N-SH细胞中,八氯腺苷处理24～96 h时,磷酸化ATM、磷酸化Chk1/Chk2、磷酸化Cdc25C以及磷酸化Cdc2的水平呈现逐渐降低的趋势.结果提示,SK-N-SH细胞在八氯腺苷处理后发生了G^₂检验点失败.蛋白质免疫印迹分析还显示,八氯腺苷可诱导p53在SH-SY5Y细胞的表达,但却不能影响SK—N-SH细胞的p53组成性表达水平.p21在SK-N-SH的组成性表达随八氯腺苷处理时间延长而逐渐减少,但在处理前后的SH-SY5Y细胞均未检测到p21蛋白的表达.上述实验结果提示,八氯腺苷抑制两种细胞增殖的机制不同：在SH-SY5Y细胞,八氯腺苷可激活ATM-Chk-Cdc25C-Cdc2/cyclin途径和凋亡通路,使细胞发生G_²/M期阻滞和细胞凋亡;在SK-N-SH细胞,八氯腺苷诱导G^₂检验点失败,导致细胞阻滞在有丝分裂期,并发生有丝分裂异常.2种不同的细胞命运可能还与p53和p21表达不同有关.     

低剂量顺铂通过p38MAPK介导的DNMT1下调降低p21与p16启动子甲基化上调p21与p16表达

低剂量顺铂可通过诱导p21与p16表达而诱导肿瘤细胞早衰,但其机制不明。本研究探讨了低剂量顺铂诱导的HeLa细胞衰老过程中p21与p16的上调机制。低剂量顺铂（4 μmol/L）处理HeLa细胞后,DNA甲基转移酶DNMT1蛋白水平降低;p21与p16启动子甲基化水平降低,二者mRNA及蛋白质水平升高;顺铂对DNMT1蛋白水平的降低作用与其激活p38MAPK有关,用SB203580抑制p38MAPK可部分逆转顺铂对DNMT1蛋白水平以及p21与p16启动子甲基化的降低作用,从而部分逆转顺铂对p21与p16表达的诱导;抑制p38MAPK 也可部分逆转低剂量顺铂诱导的HeLa细胞早衰。上述结果表明,低剂量顺铂可通过p38MAPK信号通路下调p21与p16启动子甲基化水平,进而上调二者的表达。这些结果为解析低剂量顺铂诱导肿瘤细胞早衰的信号转导机制提供了实验依据。     

降钙素基因相关肽对血管内膜损伤后内皮细胞功能恢复的影响

在球囊剥脱大鼠主动脉内膜造成的内皮损伤模型上,用ＣＧＲＰ（１０μｇ／ｋｇ／ｄ）治疗后观察血管内皮合成释放ｖＷＦ含量及ｔ－ＰＡ活性的变化。结果表明ＣＧＲＰ能明显降低ｖＷＦ含量和增加ｔ－ＰＡ活性。提示ＣＧＲＰ能减轻内皮损伤反应,在促内皮细胞增殖的同时对内皮某些功能恢复亦有一定的作用     

Gö6976转变8-氯-腺苷引起的G2/M期阻滞为S期阻滞并促进K562细胞凋亡

8-氯-腺苷可抑制多种人类肿瘤细胞生长．8-氯-腺苷可引起细胞有丝分裂异常、G2/M 期阻滞和晚期凋亡．为探索增强8-氯-腺苷的抗肿瘤作用,本研究以人慢性髓性白血病细胞株K562为靶细胞,联合使用Chk1抑制剂Gö6976与8-氯-腺苷,观察Gö6976处理后肿瘤细胞对8-氯-腺苷的增敏效果,探索其作用机制．流式细胞分析发现,Gö6976 可消除8-氯-腺苷引起的K562细胞G₂/M期阻滞,使转换为S期阻滞．蛋白质印迹及免疫共沉淀实验显示,Gö6976可灭活Chk1,激活Chk2,使Chk1-Cdc25C-CDK1级联反应转换为Chk2-Cdc25A-CDK2级联反应,从而引起细胞周期阻滞发生改变．蛋白质印迹实验证明,Gö6976 可明显增强8-氯-腺苷作用引起的凋亡相关分子procasepase-3和PARP的激活;流式细胞分析显示,Gö6976促进8-氯-腺苷引起的细胞凋亡．研究结果提示,Gö6976增强了靶细胞对8-氯-腺苷的敏感性,通过转换8-氯-腺苷引起的G₂/M期阻滞为S期阻滞,促进细胞凋亡．     

E2F1 介导8-氯-腺苷引起的人肺癌细胞H1299的凋亡

8-氯-腺苷（8-Cl-adenosine,8-Cl-Ado）可诱导人非小细胞性肺癌细胞H1299发生凋亡,但其分子机制还没有阐明．首先用四唑盐（MTT）比色法检测了8-Cl-Ado 对H1299 细胞的生长抑制作用．进一步采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting) 检测了8-Cl-Ado 处理H1299细胞后,procaspase-3 的激活情况以及E2F1的蛋白水平．通过用pcDNA-HA-E2F1表达载体和pSUPER-E2F1 RNA 干扰载体分别转染H1299 细胞,研究在E2F1 过表达和RNA 干扰（RNA interference, RNAi）两种情况下对凋亡的影响．实验结果表明,8-Cl-Ado可抑制H1299 细胞的生长,激活凋亡关键执行蛋白procaspase-3,升高E2F1 蛋白水平．当E2F1 过表达后,同时伴有procaspase-3 的激活,而E2F1 表达受到抑制后,与对照相比,8-Cl-Ado 引起的procaspase-3 的激活被明显抑制,说明E2F1 介导8-Cl-Ado 引起的人肺癌细胞H1299 的凋亡．     

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶（calcineurin）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）的关系.结果显示, 原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调. RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接 影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.