siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

昆虫细胞—杆状病毒表达系统表达尿激酶原

在转瓶和２Ｌ搅拌反应器中,利用重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ感染ｓｆ９昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度１２×１０６／ｍＬ、ＭＯＩ＝３０时,尿激酶原活性达到１０６５ＩＵ／ｍＬ。研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。     

PDX-1表达质粒的构建及表达

目的:为进一步研究PDX-1基因的功能打下基础.方法:从人的胰腺cDNA中PCR扩增PDX-1基因的阅读框架,构建质粒pAAV-PDX-1.用pAAV-PDX-1转染293T细胞48小时后,用RT-PCR和Western Blot方法检测293T细胞中mRNA和蛋白水平PDX-1的表达.结果:转染了pAAV-PDX-1的293T细胞中有PDX-1的表达,而在转染质粒pAAV-MCS和未转染的293T细胞中均没有检测到PDX-1的表达.结论:构建的pAAV-PDX-1质粒在mRNA和蛋白水平都能表达PDX-1.     

表达芯片筛选类风湿关节炎特异表达基因

为了寻找类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA)新的特异性表达标记物,应用基因芯片对RA、骨关节炎（osteoarthritis,OA）和强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）患者关节滑膜组织的基因表达谱进行比较,并采用实时定量PCR方法对芯片结果进行验证. 全基因组表达芯片的结果显示,与OA滑膜组织及AS滑膜组织相比,在RA患者的滑膜组织中,CD38,ANKRD38,E2F2,CFDP1, CD7, ISG20 和IL2RG基因表达异常|实时定量PCR结果证实,RA患者滑膜组织中,CD38、E2F2和IL2RG基因表达明显增高.     

基因突变及其表达

基因突变亦称为“点突变”,因为从细胞水平来看,基因是染色体上的一“点”;从分子水平看,基因突变是     

Sirt3过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Sirt3全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Sirt3全长基因并克隆入pc DNA3.1载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1000 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的pc DNA3.1-Sirt3质粒转入AGS和SGC-7901细胞,检测到Sirt3的m RNA和蛋白表达水平均提高。结论:构建获得Sirt3基因高效真核表达载体,将用于Sirt3的功能研究。     

大肠杆菌表达系统表达载体的类型及其研究进展

大肠杆菌表达系统是基因工程中不可缺少的工具,近年来,有关大肠杆菌表达载体的研究很多,本就其种类及其进展作一综述。     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。