透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

一个热诱导穿梭表达载体的构建及其在链霉菌中的应用

为探索大肠杆菌λ噬菌体表达调控元件在链霉菌中的应用,构建了一个链霉菌大肠杆菌穿梭表达载体pHZ1080,并将来自链霉菌FR-008的聚酮合酶(PKS)基因置于其中的λ噬菌体启动子P_R下游,得到表达PKS的穿梭质粒pHZ1067。与在大肠杆菌中一样,该质粒在变铅青链霉菌中也受热诱导表达100kD的PKS蛋白;表达的PKS蛋白可由SDSPAGE和Western-blot实验检测到。PKS在链霉菌中的热诱导表达表明,构建的载体也能用于链霉菌诱导表达外源基因。       

在变铅青链霉菌基因组中定域克隆外源DNA的置换性载体及通过反选择获得重组体的模式方法

ΦHAU3^R是变铅青链霉菌66中对噬菌体ΦHAU3显示抗性的基因,已从基因组中获得分离。将基因组中邻近于该基因两侧的一个3.5kb和另一个3.8kb的DNA片段分别以其在染色体上的天然取向插入到一个由pIJ101衍生的质粒pIJ653上,构建成pHZ806。然后在pHZ806上对应于pIJ101复制子的区域中插入一个spc/str抗性基因,同时在3.5kb和3.8kb片段之间插入一个潮霉素抗性基因(hyg),衍生出一个新质粒pHZ808。由于pHZ808中不具有完整的pIJ101复制功能区,所以它不能在链霉菌中复制。然而,在该质粒3.5kb和3.8kb片段之间插入的任何DNA片段,在导入到变铅青链霉菌中后都可借助于3.5kb和3.8kb两个片段与内源染色体的同源区域所发生的双交换而稳定地整入到内源染色体的特定区域(3.5kb和3.8kb片段之间),同时置换出染色体上的ΦHAU3-R基因。发生了这种基因置换的重组子菌株会对噬菌体ΦHAU3变得敏感,这种反选择方法可用来浓缩和初选携带定域插入片段的重组子。已利用潮霉素抗性基因(hyg)作为一个模式基因片段阐明了这种载体和这种在染色体上定域克隆外源基因片段的方法学和适用性。同时,用pHZ808作载体克隆另外的基因片段时还有另一个优越性：hyg可作为报告基因一同参与外源基因片段的定域整合,携带插入片段的重组子除了对噬菌体ΦHAU3显示敏感性以外,还对潮霉素显示抗性。     

透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

分别用质粒pJJ699与pUC19(vhb),pIJ702与pBR322(vhb),构建大肠杆菌链霉菌穿梭质粒,将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下,透明颤菌血红蛋白的表达,可提高金色链霉菌氧的利用效率,产物合成比原始菌株提高40%～60%。在局部低氧的环境中,采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达,可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率,优于透明颤菌血红蛋白基因受溶解氧调控的天然启动子。     

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ,用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达,但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导,则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失,但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子,且可在阿维链霉菌中稳定遗传,却不能再转化大肠杆菌。     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

将含有G138P单点突变和G138P-G247D双点突变的GI结构基因,分别克隆入E.coli链霉菌穿梭载体pHZ1272,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK54菌株。30℃振荡培养24h,加入2 μg/mL 硫链丝菌素诱导表达12h。SDSPAGE电泳表明,两个穿梭载体在TK54菌株内表达出425 kD特异性条带。薄层扫描显示,突变体酶GIG138P和GIG138PG247D分别约占可溶性蛋白的19%和22%。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138PG247D在变铅青链霉菌TK54中获得了表达。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白需要异源启动子

构建了质粒pIJ4083Mpro、pIJ4083\|pro\,pWLD8和pFW3。在浅青紫链霉菌TK24中,启动子探针质粒pIJ4083上的邻苯二酚双加氧酶基因(xylE)不能被透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的启动子带动转录,表明vgb启动子在链霉菌中无作用。TK24中,pWLD8和pFW3均能表达透明颤菌血红蛋白(VHb),pWLD8上可能是由Plac带动vgb的表达;pFW3上vgb基因去掉了非必要部分,克隆在PCR扩增得到的glnA启动子下游,两者连成嵌合基因。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对基因细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌（S.cinnamonensis)是莫能菌素（Monensin)的产生菌,大肠杆菌－链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因（vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子ＰtipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的ＶＨb蛋白,摇瓶发酵实验证明,ＶＨb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

Beta-lactamase genes of Streptomyces badius, Streptomyces cacaoi and Streptomyces fradiae: cloning and expression in Streptomyces lividans

Genes encoding extracellular beta-lactamases (EC 3.5.2.6) of Gram-positive Streptomyces badius, Streptomyces cacaoi and Streptomyces fradiae have been cloned into Streptomyces lividans. The beta-lactamase gene of S. badius was initially isolated on a 7 kb BamHI fragment and further located on a 1300 bp DNA segment. An 11 kb BamHI fragment was isolated encompassing the S. cacaoi beta-lactamase gene, which was subcloned to a 1250 bp DNA fragment. The beta-lactamase gene of S. fradiae was cloned on an 8 kb BamHI fragment and mapped to a 4 kb DNA segment. Each of the three BamHI fragments encompassing the beta-lactamase genes hybridized to a BamHI fragment of the corresponding size in chromosomal DNA from the respective strain used for cloning. The activities of the three beta-lactamases were predominantly found to be extracellular in the S. lividans recombinants. The S. badius and S. cacaoi beta-lactamases exhibited a 10-100-times lower activity in S. lividans, whereas the S. fradiae beta-lactamase showed an approximately 10-fold higher activity in the cloned state, compared with the activities found in the original strains.     

Properties of Ribosomes from Streptomyces erythreus and Streptomyces griseus

Ribosomes from an erythromycin-producing strain, Streptomyces erythreus, lacked affinity for erythromycin and were also resistant to other macrolide antibiotics (leucomycin, spiramycin, and tylosin) and to lincomycin, whereas Streptomyces griseus B(3) ribosomes were susceptible to all of these antibiotics.     

Streptomyces cloning vector derived from Streptomyces lavendulae-grasserius mini-plasmid pSLG33

Abstract The cryptic multicopy plasmid designated pSLG33 (2.65 kb) was isolated from the vegetative mycelium of Streptomyces lavendulae-grasserius RIA 746 and physically characterized. pRS410 vector (5.4 kb) was constructed by insertion of aph and tsr genes coding for neomycin and thiostrepton resistance, respectively, in a non-essential part of the plasmid molecule. The pRS410 is compatible with multicopy Streptomyces plasmid vectors derived from pIJ101 plasmid.     

Comutation in Streptomyces

Up to 6% of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced back mutations in the hisA locus of Streptomyces coelicolor were forward mutations (comutations) in another closely linked his locus.