重组病毒杀虫剂应用研究进展

应用分子生物学技术可以将昆虫特异性的毒素基因、某些酶基因等外源基因插入昆虫病毒基因组,或通过改造昆虫病毒基因组等方法构建重组病毒杀虫剂,提高杀虫效果。温室及田间释放实验证实,重组病毒杀虫剂可以显著提高现场防治效果。连续多代抗性筛选实验表明,宿主被诱导产生对重组病毒杀虫剂抗性的速度低于野生型病毒杀虫剂。采用在剂型中添加光增白剂等保护剂、在基因组中插入具有增效作用的基因、应用病毒增强蛋白等技术可以提高重组病毒杀虫效果。随着基因工程技术的发展和安全性研究的深入,以重组杆状病毒为主的重组昆虫病毒杀虫剂的应用研究正面临着突破。     

具有生物安全性的杆状病毒杀虫剂基因工程技术的发展与前景

杆状病毒作为杀虫剂在世界各地已被广范应用．但与化学农药相比,杆状病毒具有杀虫速度慢,对高龄害虫需用量大,杀虫谱窄等缺点．随行基因工程技术的发展,从80年代末期起,科学家开始尝试对杆状病毒的遗传性状进行各种分子生物学改造,以获得更优良的病毒虫剂。近年来这方面的研究已取得了可喜进展,同时重组病毒的安全性也引起了世界范围的广泛关注。因此．研制既有优良杀虫性能,又有生物安全性的重组病毒．已成为当今病毒杀虫剂的发展方向。本文及时地总结了重组杆状病毒杀虫剂研究的历史,从提高病毒杀虫速度、增强病毒杀虫毒性、以及病毒宿主特异性等三个方面进行了系统归纳,并对重组病毒的安全性进行科学地分析。重点阐述了新时期研制具有生物安全性的重组病毒的各项基因工程策略,如对重组病毒进行混合包装、前包装：或生产缺陷型的重组病毒（p10基因,p74基因．egt基因,pp34基因的缺失）等。这些措施将把重组病毒对环境可能造成的危害控制在最小范围。理想的重组病毒杀虫剂应具有杀虫快、杀虫谱广、不危害其它生物、在环境中滞留时间短等特点。     

蜘蛛毒素型生物杀虫剂在开发中

美国天然产品科学公司(NPS)(犹它州盐湖城)和TMC集团(伊利诺依斯州芝加哥市)正以一种蜘蛛毒素跨入生物杀虫剂竞技场。这种毒素对人无害,但对于主要作物害虫却是致命的。现已将这种毒素的基因克隆于能攻击毛虫(尤其是夜蛾)的重组病毒之中。不过,两公司还必须确定这种杀虫剂在经济上是否能站住脚,以及在大田中的药效持续时间能否与常规杀虫剂相竞争。两公司认为他们至少已经解决了应用蜘蛛毒素时的两个关键问题,即接触或摄食无效、在环境中降解太快,不能象常规杀虫剂那样施用。科学家将此毒素基因插入昆虫病毒中,从而攻破了这两道关卡。喷     

昆虫病毒的增强蛋白

在某些昆虫病毒的包涵体中相继发现了增强蛋白．这类蛋白可以增强核型多角体病毒对昆虫幼虫及体外培养的昆虫细胞的感染力,缩短杀虫时间,提高杀虫效率;还可以增强其他生物杀虫剂（如：Bt）的毒力．关于增强蛋白的作用机制有两种观点：降解围食膜以利于病毒粒子侵染细胞或直接作用于细胞质膜促进病毒粒子的套膜与之融合．该蛋白是由病毒编码的,现已克隆出第一个增强蛋白基因,该基因含有一个2703bP的开放阅读框,其核苷酸序列分析业已完成．增强蛋白的发现有望对病毒杀虫剂的推广产生积极影响．     

表达蝎毒素的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的构建及毒力

【目的】开发高毒力的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)杀虫剂。【方法】构建编码蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(ecdysterioid UDP-glucosyl transferase gene,egt)基因缺失并插入东亚钳蝎神经毒素(B.martensi Karsch,BmK ITa1)基因的重组转移载体,重组转移载体与SpltMNPVⅡ基因组DNA共转染斜纹夜蛾细胞,通过荧光斑法与有限稀释法相结合筛选重组病毒。【结果】成功筛选出缺失egt基因的、早期启动子(ie-1)启动的、表达BmK ITa1成熟肽的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-ie-1-BmK ITa1。生物测定结果显示,重组病毒的杀虫速度(LT50)较野生病毒提前0.7-0.8 d。【结论】通过在SpltMNPV病毒基因组中插入外源毒素基因可明显增强病毒的杀虫效果,结果说明开发高毒力SpltMNPV生物杀虫剂具有可行性。     

Bt毒素的说服性受疑

小小烟芽夜蛾,动摇了苏芸金杆菌(Bt)毒素王国的根基。该领域的某些中心教义已受到怀疑。此外,它还让人们开始怀疑利用Bt 毒素开发抗虫重组DNA 植物是否明智之举。以Bt 为基础的生物杀虫剂,其炫目之处在于:害虫能产生对化学农药的抗性,却不能对天然(即生物)杀虫剂产生抗性。可是,时隔不久,这一点已被推翻。不论是实验昆虫,还是野生昆虫,吃了含有Bt毒素的食物之后均存活下来。然而,谁也没有惊慌失措,因为人们相信,对来自不同菌株的Bt 毒素产生交     

棉铃虫病毒杀虫乳悬剂的生产及其药效试验

成功研制出棉铃虫病毒（ＮＰＶ）杀虫乳悬剂,改进了生产工艺和设备,建立了棉铃虫的室内品系,提高了生产效率,建立了产品的检测方法,提高了产品质量,促使棉铃虫病毒杀虫剂商品开发获得成功。大田试验证明,病毒乳悬剂的防治效果,相当于当前推广的化学农药,优于原病毒可湿性粉剂。相同剂量（０．５３一１．０７×１０（１０）ＰＩＢ／公顷）的病毒乳悬剂可使虫口平均减退９１．７％,而病毒可湿性粉剂为８３．７％。     

基因工程重组杆状病毒杀虫剂研究进展

基因工程重组杆状病毒杀虫剂研究进展王福山,朱反修,齐义鹏（武汉大学病毒研究所,武汉４３００７２）关键词：基因工程,重组杆状病毒,杀虫剂目前,由于化学农药污染环境,在杀死害虫的同时,也杀死了有益的天敌昆虫,破坏生态平衡。并且,有毒化学农药的长期使用使害虫的抗药性不断增强,原来用低剂量就能防治的害虫要提高用药量的几倍甚至几十倍才能防治”。因此,对害虫的生物防治越来越受到重视。     

多杀菌素生物合成的分子机理与定向遗传改造策略

多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌产生的次生代谢产物．主要活性物质为spinosyn A和spinosyn D,是一种新型的高效广谱大环内酯类杀虫剂,因其独特的杀虫机理而兼具生物农药的安全性与化学农药的快速性．简述了多杀菌素生物合成的分子机理,包括聚酮链的生物合成与修饰、NDP糖的合成、修饰与连接转移以及多杀菌素生物合成基因表达调控．通过对多杀菌素生物合成的限速步骤及相关基因的分析．探讨了提高多杀菌素产量与合成其新衍生物的定向遗传改造策略,并展望了其应用发展前景．     

以neo作选择标记富集和筛选阳性重组杆状病毒

将苜蓿银纹夜蛾(AcNPV)极早期基因IEI启动子控制的neo基因表达盒插入p10型转载体pAcEP106中得到pAcPIneo,将它和野生型AcNPV DNA共转染Sf细胞得到neo^+重组病毒.因为neo基因的表达使得neo^+基因的重组病毒可以在G418的存在下复制,而野生型则不能.将共转染得到的上清液以很低的感染复数连续传代,通过G418的选择作用,使重组病毒得到富集,三代以后重组病毒比例可达90%以上,如此之高的重组比例使得重组病毒的筛选不须经空斑纯化只须有限稀释即可得到.利用杆状病毒早期基因启动子表达neo基因为用早期基因表达外源毒素基因作重组病毒杀虫剂打下了基础,同时也建立了一种简便有效的筛选、富集阳性重组病毒的方法.     

生物防治

941555遗传工程病毒杀虫剂:改良表型的新型杀虫剂[会,英]/Posspe,R.D.…∥Pestic.Sci.-1993,39(2).-109～115[译自DBA,1993,12(26),93-15210] 为改良生防因子毒株,将外源基因掺入杆状病毒基因组中。讨论内容包括:(1)状杆病毒,特别是核多角体病毒,的复制;(2)杆状病毒表达     

蜡蚧轮枝菌毒素对温室中烟粉虱种群控制作用的评价

在室内测定蜡蚧轮枝菌毒素对烟粉虱种群干扰作用基础上,通过分别组建蜡蚧轮枝菌毒素和化学杀虫剂作用下的烟粉虱第5、6代自然种群生命表,采用种群趋势指数（I）和干扰作用控制指数（IIPC）分析法,比较蜡蚧轮枝菌毒素和化学杀虫剂对茄子上烟粉虱的防治效果,评价蜡蚧轮枝菌毒素对烟粉虱的防治作用。结果表明,毒素对烟粉虱室内种群的干扰作用主要表现在对成虫的忌避作用和对若虫的毒杀作用;温室大棚中施用400mg／L的蜡蚧轮枝菌毒素,对烟粉虱第5代和第6代的控制指数IIPC分别为0．064和0．023,连续施用毒素后,第6代种群趋势指数Ⅰ为0．68,烟粉虱种群基本得到控制;温室大棚中施用重量10％吡虫啉可湿性粉剂（稀释1000倍）,对烟粉虱第5代和第6代的控制指数IIPC分别为0．44和1．01,化防区第5代的I为12．95,第6代的I为30．23,分别为对照区的0．44倍和1．01倍,连续使用化学杀虫剂,容易造成烟粉虱再猖獗。重要因子分析揭示毒索比化学杀虫剂更利于温室烟粉虱种群控制。     

苏云金芽胞杆菌6618杀虫菌株的分离和鉴定

从我国不同地区采集118份土样,利用温度筛选法分离获得一株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)6618,镜检观察发现该菌株能产生典型的菱形晶体,PCR分析表明其含有cry1类杀虫基因。采用SDS-PAGE和质谱分析发现该菌株主要产生130 k D原毒素,其组分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成。基因序列分析表明该菌株的cry1Ac基因为已知的cry1Ac1,而cry1Ae为新型杀虫基因。毒力生测表明该菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有显著的杀虫效果。筛选获得的高毒力Bt菌株6618为丰富我国苏云金芽胞杆菌储备和研发新型高效生物杀虫剂提供了菌株资源。     

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原, 构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子表达载体。RNA和DNA复制子载体转染BHK21细胞后, 经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测, 结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达; 而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒, 该重组病毒颗粒感染细胞后, 也都能表达Hc抗原。以上结果表明, 基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得, 为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础, 从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。     

Bt遗传工程植物获EPA批准

美国环保署(EPA)首次批准限量注册含苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素基因的遗传工程植物。EPA认为,这种“植物杀虫剂”能降低常规杀虫剂的用量,并降低对公众健康和环境的危害,在掌握一定数据的 基础上,EPA确信使用这些Bt植物杀虫荆对公众健康、其它非目标微生物及环境没有危害。限量注册的目的是允许各公司开发植物杀虫剂,产生大量玉米,棉花及马铃薯种子。这一行动将推动新型杀虫剂产品的商品化。工程化的马铃薯、玉米或棉花植株均产生与在细菌中天然产生的相同的昆虫毒索(“δ-内毒     

重组杆状病毒杀虫剂研究进展

从缺失病毒非必须基因增加杀虫效果,插入外源基因提高杀虫速度、修饰病毒本身基因扩大杀虫谱等三个方面综述了目前构建重组杆状病毒杀虫剂的主要策略。     

抗昆虫蝎毒素及其转基因技术的研究与应用进展

本文综述了蝎毒中抗昆虫毒素成分的种类、理化性质、分子结构与功能 ,以及利用抗昆虫蝎毒素基因构建重组微生物杀虫剂和培育抗虫植物的研究与应用的进展情况 ,并就该技术对害虫防治的意义、所存在的生态安全性等问题和应对策略进行了探讨。     

含外源类蜗牛毒素基因的AcMNPV的虫体感染性研究

类蜗牛毒素基因(conotoxinlike,ctl)是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因,其功能尚不清楚.本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AcMNPV)bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒(BusuNPV)ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl.在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明,该基因转录出mRNA.在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定,结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50,ST50无显著性差异,表明在此系统中,外源的CTL无杀虫增效性能.     

含外源类蜗牛毒素基因的AcMNPV的虫体感染性研究

类蜗牛毒素基因(conotoxinlike,ctl)是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因,其功能尚不清楚。本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AcMNPV)bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒(BusuNPV)ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl。在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明,该基因转录出mRNA。在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定,结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50,ST50无显著性差异,表明在此系统中,外源的CTL无杀虫增效性能。     

使苹果获得Bt毒素

在美国第一例遗传工程苹果的实验中,加利福尼亚-戴维斯大学研究了杀虫剂毒素基因的适合性,该基因来自能防治苹果树害虫的苏云金芽孢杆菌亚种Bacillus thuringiensis kurstaki菌株HD-73,已在各种其它植物上对该基因成功地进行了转基因试验。A.M.Dandekar及其合作者果树学系的Matsutu