Mn~(2+)和Cu~(2+)与脂质体和脂酶体相互作用的ESR研究

用ESR实验研究了Mn~(2 )、Cu~(2 )与DOPC,DPPC,SPL,DOPA,DPPA脂质体及其与H~ -ATP酶复合体重组的脂酶体的相互作用.通过Mn~(2 )—ESR谱线强度以及Cu~(2 )—ESR谱g因子的测量得出,磷脂分子头部不同的化学组成及其脂酰链的不同状态决定了Mn~(2 )、Cu~(2 )与膜脂结合的强弱程度,通过脂质体和脂酶体中自旋标记物5NS—ESR谱的测量进一步得出Mn~(2 )的结合增大了膜脂排列的序参数,而酶复合体的嵌入都导致与膜脂结合的Mn~(2 )比例减小.因而,当Mn~(2 )与脂酶体相互作用时,膜脂的排列最终达到一个平衡状态.在中性磷脂脂酶体的膜与Mn~(2 )之间,这种相互作用不明显.     

Mg~(2+)加强嵌有H~+-ATP酶脂酶体脂质分子的堆积(packing)

用亲脂性的灵敏的荧光MC 540标记在有Mg~(2+)(1mM)与无Mg~(2+)条件下重建的线粒体H~+-ATP酶脂酶体,后者的荧光强度较前者增加30%左右.这提示,含Mg~(2+)的脂酶体的脂质分子间的堆积紧密度增加.在N-AF系列(n=27和16)探剂与MC 540之间的能量转移效率,又以反应靠近脂双层表面变化的2-AP与MC 54O之间最高.这进一步表明,含Mg~(2+)的脂酶体具有较适合流动性是与Mg~(2+)通过调节靠近脂双层表面的脂质分子具有适度的堆积相关的.这对阐明我们已提出的Mg~(2+)促进线粒体H~+-ATP酶重建作用模型进一步提供了较直接的证据.     

不同pH条件下R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白荧光寿命的研究

采用自己研制的时间分辨毫微秒荧光谱仪对R-藻红蛋白(R-PE )和C-藻蓝蛋白(C-PC)进行了荧光寿命的测定和研究,并对能量传递过程进行了分析和讨论.测得R-PE的荧光寿命为3.1±0.1ns,C-PC的荧光寿命为1.3±0.1ns,且在pH5—pH9的范围内不变;当pH<5时,两者的荧光寿命都有变短的趋势.我们还测定了R-PE和C-PC混合溶液中R-PE的荧光寿命不变,而C-PC的荧光寿命变长,从而表明存在着R-PE向C-PC的辐射能量传递.     

Mg~(2+)对线粒体H~+-ATP酶的F_O在脂质体重建时的影响

线粒体ATP合成酶是由具有H~+转运活性的F_0亚基,可溶性的催化中心F_1和连接二者的致寡霉素敏感蛋白(OSCP)所组成. 将纯化的猪心线粒体H—ATP酶复合体的F_0亚基,用胆酸盐透析法在有Mg~(2+)和无Mg~(2+)条件下在大豆磷脂脂质体上重建得脂酶体(L·F_0).用探剂9-AA荧光淬灭法和电权法测定了两种脂酶体的质子转运活力.由两种方法所得的实验结果均表明,在透返介质中加入1mmolmg~(2+)条件下形成的脂酶体(L·F_0)+Mg~(2+)较无Mg~(2+)者的质子转运活性明显增加.前者的荧光强度变化较后者增加约30%;由电极法测得的质子转运的初速度,前者为5nmolH~+′sF_0,后者为3nmolH~+′s·nmolF_O,质子转运活性高约一倍.这进一步支持Mg~(2+)通过调节脂的物理状态而诱导F_O具有较适合的构象,并进而将这一影响传递至F_1,使整个H~+—AhP酶具有较高活性的假设.     

Mg~(2+)对线粒体H~+-ATP酶的F_O在脂质体重建时的影响

线粒体ATP合成酶是由具有H~+转运活性的F_0亚基,可溶性的催化中心F_1和连接二者的致寡霉素敏感蛋白(OSCP)所组成. 将纯化的猪心线粒体H—ATP酶复合体的F_0亚基,用胆酸盐透析法在有Mg~(2+)和无Mg~(2+)条件下在大豆磷脂脂质体上重建得脂酶体(L·F_0).用探剂9-AA荧光淬灭法和电权法测定了两种脂酶体的质子转运活力.由两种方法所得的实验结果均表明,在透返介质中加入1mmolmg~(2+)条件下形成的脂酶体(L·F_0)+Mg~(2+)较无Mg~(2+)者的质子转运活性明显增加.前者的荧光强度变化较后者增加约30%;由电极法测得的质子转运的初速度,前者为5nmolH~+′sF_0,后者为3nmolH~+′s·nmolF_O,质子转运活性高约一倍.这进一步支持Mg~(2+)通过调节脂的物理状态而诱导F_O具有较适合的构象,并进而将这一影响传递至F_1,使整个H~+—AhP酶具有较高活性的假设.     

神经节苷脂GM3对重建Ca 2+ -ATP酶构象的调节

应用稳态荧光和纳秒时间分辨瞬态荧光技术,以不同性质猝灭剂探测了神经节苷脂GM3诱发的Ca ²⁺-ATP酶构象的变化.结果显示,GM3可使重建的Ca ²⁺-ATP酶蛋白内源荧光寿命明显延长;并且能不同程度地减弱离子性猝灭剂碘化钾(I^-)和脂溶性猝灭剂竹红菌乙素(HB)对Ca ²⁺-ATP酶色氨酸(Trp)内源荧光的猝灭程度.进一步用时间分辨荧光猝灭动力学分析,当体系中有GM3存在时,HB对该蛋白不同荧光寿命组分的Trp内源荧光猝灭的幅度减小.猝灭常数(K_sv)明显降低.说明GM3依靠其亲水糖链和疏水的神经酰胺链作用,不仅可以改变重建Ca ²⁺-ATP酶蛋白嵌于膜脂疏水区内部的构象,使位于膜脂疏水区不同部位的Trp残基更加趋向排列于亲水-疏水域界面;而且还使Ca ²⁺-ATP酶亲水-疏水结构域之间更趋接近,致使整个酶蛋白分子呈现较“紧凑”的构象,表达较高的酶活力.     

时间相关单光子计数法及其生物学应用前景

时间相关单光子计数技术是近年来发展起来的测量ns级短荧光寿命的新方法。它不仅时间分辨本领好,而且灵敏度高,测量精度高,动态范围大,输出数据数字化,便于计算机存贮和处理。本文简要地叙述了该方法的基本原理和主要技术指标,较详细地讨论了光电信增管和ns灯等关键元器件的选用原则,并且介绍了一些比较有用的系兢调整方法和性能检测方法。此技术在免疫分析和光生物学领域的应用前景,也略作介绍。     

PSⅡ核心复合物能量传递的飞秒时间分辨荧光光谱学研究

运用稳态、瞬态荧光光谱技术对光系统Ⅱ核心复合物的能量传递动力学进行研究.分别用436 nm光脉冲激发叶绿素a分子、45l nm光激发叶绿素a和β-胡萝卜素分子、473和481 nm光激发β-胡萝卜素分子,得到5组反应能量传递、电荷重组等过程的寿命组分:8～40 ps为核心天线中β-胡萝卜素分子通过相邻β-胡萝卜素分子或中间叶绿素a向叶绿素a分子传递能量的时间;85～152 ps为核心天线色素分子激发能传递时间;201～925 ps反映部分电荷重组过程;1.03l～1.2l ns为参与能量传递的色素分子从激发态衰退回到基态的时间;6.17～18.13 ns的长寿命时间组分归因于P680+Pheo-的重组过程.将荧光发射谱进行高斯解析,发现在核心复合物中还至少存在Chla 685 683、Chla 682 680、Chla679 673,677三种特征叶绿素a分子.     

血卟啉及其衍生物在水溶液和细胞内的时间分辨荧光的研究

本文报道了血叶啉衍生物(Hpd)及其由高压液相色谱法分离制备的4种主要成分以及血叶啉,血叶啉二盐酸盐和原叶啉(Ⅸ)二钠盐等8种叶啉衍生物分别在水溶液和CHO细胞内的荧光衰变动力学的研究,实验表明,除Hpd分离组分d的荧光寿命略短外,其余7种在水落液里的荧光寺命均在15ns左右,并发现它们的荧光态在细胞内衰变加快,然而,分离组分d在细胞内的荧光寿命却明显加长.根据实验结果,本文对叶啉衍生物的最低激发单线态在细胞内的驰豫过程提出了一种可能的模式,它反映了叶啉衍生物在细胞内与某种细胞组分的结合以及它们之间的能量传递.分析表明,荧光寿命的缩短意味着光敏效率的降低.     

稳态和时间分辨荧光光谱法检测pBR322质粒中十字形结构

在目的DNA不被酶切成不同片段的情况下,应用光谱方法探测pBR322质粒中十字形结构DNA的形成。吡咯脱氧胞苷(Pyrrolo deoxycytidine,PdC)取代dC掺入到pBR322质粒的特定位点(3195,3222或3281位点)。应用稳态和时间分辨荧光法研究十字形结构DNA的形成。结果显示:(1)稳态荧光特性表明,当PdC掺入到pBR322质粒的3222位点,PdC-pBR322超螺旋荧光强度大约是松弛型PdC-pBR322的4倍;与此同时,其时间分辨荧光寿命大约比松弛型PdC-pBR322长约0.3ns。当PdC掺入到3195或3281位点时,稳态荧光光谱和荧光寿命(两位点处约1.42ns)并没有显著变化。(2)随着盐浓度的增大,荧光寿命略微有变化,但不是很明显。通过检测和分析pBR322质粒的荧光光谱和荧光寿命,表明能够形成在非配对环状部分3222位点含有dC的十字形结构。在一定的盐浓度(0-100mmol/L)条件下,十字形结构能够保持其稳定性。