2—酮—L—古龙酸还原酶分离纯化及其理化,酶学性质的研究

从发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２－酮－Ｌ－古龙酸还原酶（ＫＧＲ）,测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ氏酶,对２－酮－Ｌ－古龙酸作用的Ｋｍ值为３．４２×１０＾－３ｍｏｌ,最适作用ｐＨ为６．５,最适作用温度为３０℃。２－酮－Ｌ－古龙酸还原     

L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质的研究

从５Ｌ罐发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ＳＣＢ３２９和Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＳＣＢ９３３混合菌株中差速离心收集ＳＣＢ３２９菌体,破碎,离心获得无细胞抽提液,硫酸铵分级沉淀蛋白后依次经ＤＥＡＥＣｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２和Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析分离得到了Ｌ－山梨糖脱氢酶（ＳＤＨ）,它能将Ｌ－山梨糖脱氢氧化为Ｌ－山梨酮,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测得分子量约为６０ＫＤ。动力学性研究表明它为一个典型的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ氏酶,对Ｌ－山     

维生素C发酵中2—酮—L—古龙酸还原酶的研究

由于２酮Ｌ古龙酸还原酶（简称ＫＧＲ）的存在,理论上造成了Ｖｃ合成前体２酮Ｌ古龙酸（简称２ＫＬＧ）部分被还原成Ｌ艾杜糖酸［１,２］,影响了Ｖｃ二步发酵的产率。而从Ｌ山梨糖到２酮Ｌ古龙酸的转化中,除被ＫＧＲ催化的还原负反应外,均属...     

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)SCB3 2 9以D 山梨醇为底物培养时可产生微量 2 酮基 L 古龙酸 ;而葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)SCB1 1 0能将D 山梨醇以较高效率转化为L 山梨糖 ,但不产 2 酮基 L 古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养 ,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等 ,确定其主要的代谢产物是 2 酮基 L 古龙酸。     

L－山梨糖发酵生产2－酮基－L－古龙酸的最佳组合新菌系的生物特性的研究

从２２个不同组合的发酵Ｌ山梨糖生成２－酮基－古龙酸的组合菌系中选出了最佳组合新菌系Ｈ１９Ｓ１９。对该菌系的形态学及生理生化特性的研究表明,其中Ｈ１９为地衣芽枪杆菌（ＢａｃｉｌｌｓＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）,是Ｓ１９的伴生菌;Ｓ１９是产生２－酮基－古龙酸的菌株,具有许多特点,其分类位置暂无法确定。     

诺卡氏菌形放线菌β甘露聚糖酶的纯化和性质

产β１ ,４Ｄ甘露聚糖酶的诺卡氏菌形放线菌（ Ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 菌株ＮＡ３５４０ ,发酵培养７２ｈ ,发酵液离心去菌体,上清经硫酸铵沉淀,９５ ％ 乙醇沉淀,ＣＭＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 柱层析、羟基磷灰石柱层析、ＤＥＡＥ纤维素离子交换及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 分子凝胶过滤柱等步骤,β甘露聚糖酶的比活提高了１３７ 倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品。经ＳＤＳＰＡＧＥ 和凝胶过滤法分别测定β甘露聚糖酶分子量为４１ｋＤ和４０ｋＤ,证明该酶为单聚体;用等电聚焦电泳测得其等电点为４－８ ;经氨基酸组成分析,发现蛋白中有较高含量的Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ 及Ｇｌｕ 残基。该酶的最适反应温度为７５ ℃,在不超过６０ ℃时酶活较稳定;酶反应的最适ｐＨ 为８－０ ,ｐＨ 稳定范围为６－５～１１－０ 。重金属离子Ｈｇ^２＋ 、Ｃｕ^２＋ 、Ｐｂ^２＋ 、Ｆｅ^3＋ 、Ｃｏ^２＋ 、Ｚｎ^２＋ 能强烈抑制该酶活性,而Ｍｎ^２＋ 、Ｆｅ^２＋ 、Ａｇ^＋ 对该酶有部分的抑制作用,低浓度的Ｎａ^＋ 、Ｋ^＋ 、Ｌｉ^＋ 对该酶基本没有影响。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S₂（Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,Q Sepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S₂发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S₂基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5ɑ,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）从12 000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719^#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719^#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

芽孢杆菌M_(50)产生β甘露聚糖酶的条件研究

从土壤中分离到９ 株产生β甘露聚糖酶的芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ．） 。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ ． Ｍ５０２５０ｍ Ｌ三角瓶摇瓶培养试验,以４ ％ 的魔芋粉为碳源,１－０ ％ （ ＮＨ４）２ＳＯ４ 为氮源,０－３５ ％Ｎａ２ＣＯ３ ,３０ ～３４ ℃培养６０ｈ 产酶达到高峰。酶活力为１８０ ～２００ｕ／ｍ Ｌ。１００Ｌ 罐发酵,在３０ ～３２ ℃,１∶０ ．７５ｖｖｍ 通气量,２００ｒ／ｍｉｎ 条件下,发酵液酶活力高达３３０ｕ／ｍ Ｌ。酶的最适反应温度和ｐＨ 分别为５０ ℃和６－０ ,低于５０ ℃,ｐＨ５ ．０ ～７ ．０ 酶稳定。Ｆｅ^３＋ 、Ａｌ^３＋ 、ＥＤＴＡ、Ｈｇ^２＋ 对酶有抑制作用,而Ｂａ^２＋ 、Ｍｎ^２＋ 对酶有激活作用。发酵粗酶液对苎麻精干麻精练,显示对精干麻的半纤维素残胶具有降解作用。     

微生物混合培养从D-山梨醇产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究*

在成功利用SCB329和SCB110混合培养完成从D-山梨醇转化产生2-酮基-L-古龙酸的基础上。为了消除副产物和获得高的产量,首先对两菌搭配比例,初始pH值、培养基成分等发酵培养条件进行单因子实验,在此基础上采用L9(3⁴)正交实验优化其发酵培养基,其最终的优化培养基的成分为:D-山梨醇9g,玉米浆1.5g,尿素1.5g,磷酸二氢钾0.1g,碳酸钙0.2g。用优化后的培养基发酵,没有检测出副产物2-酮基-D-古龙酸,2-酮基-L-古龙酸产量提高了20％。     

2—酮基—L—古龙酸高产融合子15的形态学及生理生化特征的研究

由地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和２—酮基—Ｌ—古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体融合,得到了既能独立生长传代,又能产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的１５号融合子。其菌落和菌体形态类似于Ｈ１９亲本,其生理生化特性也大多酷似Ｈ１９亲本而不同于Ｓ１９亲本。但其产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的特性、乙醇氧化反应、石蕊牛奶产酸以及精氨酸双水解酶阴性等特点又酷似Ｓ１９亲本而不同于Ｈ１９亲本。其氧化酶反应、初始生长ｐＨ范围、苯丙氨酸和色氨酸脱氨酶反应则不同于双亲本。其菌体的氨基酸组份及含量也与双亲有一定差异。     

普通生酮基古龙酸菌中山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的纯化及酶学性质分析

【目的】对源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare WSH-001)的山梨糖脱氢酶(Sorbose dehydrogenase,SDH)和山梨酮脱氢酶(Sorbosone dehydrogenase,SNDH)的酶学性质进行分析。【方法】以K.vulgare WSH-001基因组DNA为模板,PCR扩增得到山梨糖脱氢酶基因(sdh)和山梨酮脱氢酶基因(sndh),构建重组表达质粒p ET28a-sdh、p ET28a-sndh,并分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中。利用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析得到纯化的SDH和SNDH。【结果】成功构建产SDH和SNDH的大肠杆菌BL21(DE3)并对目的酶进行纯化。SDS-PAGE分析结果表明,SDH和SNDH的大小分别为64 k Da和48 k Da,与理论预测值一致。显色法测得SDH酶活为3.15 U/mg,最适反应温度为30°C,最适反应pH为8.0左右;SNDH酶活为6.12 U/mg,最适反应温度为35°C,最适反应pH为8.0左右。在pH 3.0、4.0、5.0的偏酸性条件下,2个酶的酶活受到显著影响。【结论】表达并纯化了来源于普通生酮基古龙酸菌来源的SDH、SNDH,并进行了酶学性质分析,为利用SDH、SNDH实现维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的一步法发酵生产提供了必要的参考。     

高活性反硝化颗粒污泥的研究

以上流式厌氧污泥床（ＵＡＳＢ）反应器中的反硝化颗粒污泥为样品,研究了颗粒污泥的基本特性。测定出颗粒污泥中的优势无机元素为Ｃａ、Ｐ．颗粒表面以球菌和短杆菌为主。反硝化菌是颗拉中的优势菌群,数量可达６．５ｘ１０^８－１．５ｘ１０^１０个／ｍｌ颗粒污泥。初步鉴定了两株脱氮菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＮ_１和ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎＮ_２．     

用原生质体融合技术选育2—酮基—L—古龙酸高产菌株的研究

对革兰氏阳性的地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和革兰氏阴性的２－酮基－Ｌ－古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体的制备条件进行了研究,并采用聚乙二醇作诱导剂进行了两菌株的原生质体融合,用链霉素作为抗性标记对融合子进行了选择。从１７株产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子１５号。融合子１５号具有两个亲本菌株所具有的一些特性。     

维生素C混合发酵中产酸菌基因文库的构建

在对氧化葡萄糖酸杆菌ＳＣＢ３２９的纯培养方法进行了探索并获得了一定量的纯培养的ＳＣＢ３２９菌体的前提下,用常规方法抽提得到Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　ＳＣＢ３２９染色体ＤＮＡ。选用质粒ｐＫＳ作为载体,该载体具有氨苄抗性以及ｌａｃＺ基因．用限制酶对染色体进行部分消化,将一定范围内的消化片段回收后与载体连接,连接产物转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５ａ感受态细胞,利用蓝白斑特性选出重组子构建ＳＣＢ３２９基因组文库。用低熔点琼脂糖将ＳＣＢ３２９菌体包埋起来,对包埋在凝胶块中的细菌     

高产稳产聚羟基烷酸的重组大肠杆菌的构建

重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ） 含有携带聚羟基烷酸（ＰＨＡ） 合成基因（ ｐｈａＣＡＢ）＊＊ 的质粒ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ,是很有潜力的ＰＨＡ 生产菌,但存在着质粒不稳定和不能合成３羟基丁酸（３ＨＢ） 与３羟基戊酸（３ＨＶ） 共聚物［Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ）］ 的缺陷。将ＲＫ２ 质粒上的ｐａｒ ＤＥ 基因引入ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ 构成质粒ｐＪＭＣ２ ,该质粒可以在宿主Ｅ．ＣｏｌｉＨＭＳ１７４ 中稳定遗传。将培养基中的磷酸盐浓度降至１８ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,发现Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） 能够以丙酸为前体合成Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为５ ％ ～８ ％ 。在５Ｌ自动发酵罐中分批补料培养Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） ,培养基初始磷酸盐浓度为１５ ｍ ｍｏｌ／Ｌ,３０ ｈ 后每升培养液中干菌体可达４２－５ ｇ,Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） 占干重的７０ ％ ,其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为４－９ ％ 。     

L-山梨糖流加发酵高效生产2-酮基-L-古龙酸

实验充分利用混合菌系氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合发酵的优良特性,通过在发酵过程中间歇流加L-山梨糖的方法,实现了在自动控制温度、pH和溶氧的条件下,高效发酵L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的目的。结果表明：当将L-山梨糖的终浓度调高到14％(w／v)时,2-KLG产量为130mg／mL左右,转化率达90％,发酵周期40—60h之间。结论：发酵过程中间歇流加L-山梨糖可以解除高浓度糖对产酸的抑制作用,提高了糖的转化率,但是发酵周期略有延长。     

一株产虾青素的黄杆菌CF-60的研究

从土壤中分离到一株黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ）Ｃ_Ｆ－６０,该菌的生长需Ｍｇ^２＋存在,ＭｇＳＯ_４·７Ｈ_２Ｏ的最适浓度为０．２％;蛋白胨是该菌株生长的最好氮源,它不能利用无机氮。种龄超过９６ｈ的菌体不能在新鲜培养基中生长。经５４ｈ的２Ｌ恒化器发酵,生物量达６．８ｇ／Ｌ,色素产量为１０．６ｍｇ／Ｌ。该菌产生的类胡萝卜素成分简单,主要成分的含量为９０．３％,该成分经初步鉴定是分子结构中含有羰基和羟