适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术

以黄麻品种'9511'幼苗为试验材料,研究其根部蛋白提取方法的得率及不同的蛋白样品溶解方法、电泳上样量和IPG胶条pH范围对双向电泳图谱的影响.结果表明:采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取黄麻根部蛋白质,蛋白得率为80 mg/g;蛋白粉末溶解采用两次水化法,裂解液中含有7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质和1 mmol/L PMSF,能够较充分地溶解蛋白质,且制备的样品浓度能够满足双向电泳上样要求;上样量为400 μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)采用pH 4～7、17 cm的IPG胶条时所得图谱质量最佳.研究表明,样品的制备及IEF有效除盐对获得理想的2-DE图谱非常关键;取材、染色等细节对2-DE的重复性影响很大.     

猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响

比较不同的蛋白制备方法,寻找适合猪卵泡液的双向电泳样品制备方法,提高2-DE图谱的分辨率和重复性。利用ProteoExtract Albumin/IgG Remove Kit去除卵泡液中的高峰度蛋白;然后分别用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和超滤法进行样品浓缩,比较分析对2-DE图谱的影响。结果表明,TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白样品获得的电泳图谱质量较好,蛋白斑点数目较多,斑点较清晰、圆滑,分辨率较高,重复性较好。TCA-丙酮沉淀法更适合于制备猪卵泡液的双向电泳蛋白样品,为进一步对猪卵泡液2-DE图谱进行分析、鉴定及寻找生物标记物提供了保证。     

山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术的建立

以山黧豆叶片为材料,比较分析了蛋白质的不同提取方法,在此基础上着重于样品制备。对IPG胶条的选择,第一向等电聚焦和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳程序及参数、染色方法等相关技术进行了比较和条件优化。结果显示：采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质,裂解液中加入Tris-base作为蛋白酶抑制剂,等电聚焦电泳时延长低电压的电泳时间（30V、12h,500V、1h,1000V、2h）以促进盐离子泳出的方法对山黧豆叶片蛋白质进行双向电泳,并用考马斯亮蓝和银染复合染色法进行凝胶染色,能够获得蛋白点清晰的双向电泳图谱,说明用优化后的方法建立起的山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术,蛋白质样品制备质量好,电泳分辨率高,完全适合于进一步的蛋白质组学研究。     

发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

为建立适用于发菜(Nostoc flagelliforme)蛋白质组研究的双向电泳技术,对发菜蛋白质的提取、裂解、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行了优化,结果显示:发菜蛋白质主要分布在pH 4～7范围内,采用改良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率,裂解液含60 mmol/L DTT,24 cm IPG胶条上样量1.5 mg时不仅提高了蛋白质的溶解性,而且改善了双向电泳的分离效果,得到近800个蛋白点,且蛋白点清晰,图谱分辨率较好.采用优化后的双向电泳体系提高了发菜蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适用于发菜蛋白质组分析的双向电泳方法.     

蚜虫全蛋白提取方法的比较研究

为建立适于SDS-PAGE分析的蚜虫蛋白质样品制备平台,以便为蚜虫蛋白质的双向电泳分析奠定基础,本研究比较了TCA/丙酮沉淀、PEG提取、饱和酚抽提和直接裂解4种蛋白质提取方法.结果表明:不同样品制备方法的蛋白提取率有显著的差异,其中直接裂解法的提取率最高,为17.43 mg/g;其次是饱和酚抽提法,提取率为12.30 mg/g;而PEG制备法提取率最低,只有7.96 mg/g.利用SDS-PAGE电泳对不同的蛋白质样品进行了分析,发现在凝胶图谱上显现的条带也有明显的差异,其中饱和酚抽提法显现的条带数最多,为36条,且从14.4 kDa～116.0 kDa范围有广泛分布,条带清晰;PEG提取法条带数为30条,一些蛋白条带丢失或不明显;TCA/丙酮沉淀法的蛋白条带集中分布在25.0 kDa～67.0 kDa区域;直接裂解法条带数仅为24条,且小分子量的条带可辩率很低.通过以上结果可以得出,饱和酚抽提法最适用于蚜虫全蛋白样品的制备.     

一种适用于双向电泳分析的高效真菌线粒体提取及蛋白质制样方法

用液氮冷冻研磨法破碎真菌菌丝细胞,通过差速和蔗糖密度梯度离心分离纯化板栗疫病菌线粒体,所得线粒体产率(质量比)约为1/10~4。电子显微镜观察和蛋白印迹表明,所制备的线粒体完整性好,没有检测到其它细胞成分的污染。使用膜蛋白裂解液溶解线粒体制备蛋白样品,将蛋白样品200μg上样于pH3~10,24cm的非线性胶条进行等电聚焦,电聚焦后再进行第二向SDS-PAGE电泳分离,经银染获得重复性好、背景清晰、分辨率高(680±15个蛋白质点)的凝胶图谱。随机选择10个蛋白质点进行质谱分析,9个获得有效注释,均为线粒体特异性蛋白质,表明所制备的蛋白样品非常适合双向电泳分析及其后续的质谱鉴定。     

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF-7细胞总蛋白的提取效率.MCF-7细胞经培养后,分别采用M-PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF-7细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M-PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15~70kD,pH4.7~6.3的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M-PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF-7细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.     

小麦旗叶高纯度质膜的提取及蛋白质组学双向电泳体系的建立

以生长到Feekes 8.5时期小麦旗叶为试验材料,通过差速离心结合两相法提取 并纯化质膜蛋白,进而在裂解液选择、SDS-PAGE胶浓度及蛋白质上样量等方面对质膜蛋白质双向电泳体系进行了优化.结果表明,采用6.4% PEG 3 350/Dextran T-500 (W/W)两相体系可以获得纯度高达87.9%质膜微囊. 经TCA-丙酮法裂解蛋白,以12% SDS-PAGE分离胶对900 μg质膜蛋白进行双向电泳,在2-DE图谱上可分辨出173个蛋白点. 建立了一套用于小麦旗叶高纯度质膜的提取方法及其蛋白质组学双向电泳体系.     

北方常绿阔叶木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系优化

以北海道黄杨为模型植物,比较了3种不同叶片蛋白质提取方法,并优化了双向电泳各个环节技术体系,进一步用5种北方常绿阔叶木本植物进行验证,以建立适合北方常绿阔叶木本植物蛋白质分析的双向电泳技术体系.结果表明:(1)采用改进的酚/SDS方法提取叶片蛋白质,用添加硫脲和磺基三甲基胺乙内脂3～10的裂解液裂解蛋白,使用24 cm固相pH梯度胶条,考马斯亮蓝染色蛋白上样量800 μg,最多可得到分辨率高、重复性好的蛋白点912个;银染色蛋白上样量110 μg,最多可得到分辨率高、重复性好的蛋白点587个.(2)用优化的技术体系对5种北方常绿阔叶木本植物进行分析,结果显示5种植物叶片蛋白质2-DE图谱均背景清晰,分辨率好,重复性较好(重复组的相似系数平均为68.60%);5 种植物平均可得到约371个清晰可重复的蛋白点,其中大叶黄杨、扶芳藤、北海道黄杨、金心黄杨和小叶黄杨的2-DE重复组蛋白点数目分别为346、407、353、352和399个.表明本研究优化的蛋白质提取以及双向电泳技术体系适用于对北方常绿阔叶木本植物叶片的比较蛋白质组学分析.     

胆管癌患者与健康志愿者血清样品蛋白质表达差异分析

胆管癌（cholangiocarcinoma,CCA）是一种难于早期诊断和治疗的恶性肿瘤.利用蛋白质组学技术以期筛选出人血清中具有医学价值的胆管癌癌变的标志物.利用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中高丰度的白蛋白和IgG,再经丙酮沉淀得到高质量的血清样品.样品经双向电泳（2-DE）得到了分辨率较好的胆管癌血清的蛋白点图谱.利用Image Master 2D软件对比分析了胆管癌病人和正常健康对照组的2-DE图谱.其中,表达上调蛋白有8个,表达下调蛋白有6个.用质谱获得上述差异蛋白的肽质量指纹图谱,并经数据库检索共鉴定出了11种差 异蛋白质,其中8种蛋白质的表达与胆管癌密切相关.本研究为阐明胆管癌的机理提供了一条新途径.