百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

铁皮石斛SPL膜结合(STM)转录因子的全基因组鉴定及表达分析

SPL转录因子广泛参与植物生长发育、胁迫响应等过程。目前,没有关于铁皮石斛SPL膜结合(SPL with transmembrane motif)转录因子即STM转录因子的研究。为了探究STM转录因子在铁皮石斛生长发育及胁迫响应等方面的作用,该文在铁皮石斛全基因组水平鉴定出4个STM转录因子,并对DoSTM基因家族成员进行生物信息学分析,又利用逆转录PCR研究了DoSTM在不同组织部位及不同逆境处理下的表达情况。结果表明:(1)DoSTM1-4为亲水蛋白,均具有SBP保守结构域和一些激素响应位点。(2)4个DoSTM在根茎叶中均有表达,DoSTM2在叶中的相对表达量最低; DoSTM1/3/4的相对表达水平均无明显差异。(3)DoSTM1-4在低温、高温、干旱胁迫下的相对表达水平都有显著变化,DoSTM1/3/4的表达量降低最为明显,故推测DoSTM与植物体内激素响应、温度变化响应及抗旱性有关。这些结论为后续进一步开展铁皮石斛STM转录因子的研究提供了参考。     

垫状卷柏SpLEA1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant,LEA),广泛存在于生物体内,与植物抗逆性密切相关,可在干旱胁迫下保护植物细胞,减少植物损伤。垫状卷柏(Selaginella pulvinata)是一种在干旱胁迫下生存能力极强的蕨类植物,具有很强的恢复能力。为探究垫状卷柏SpLEA1基因在耐旱植物中的分子机制与表达特征,该研究以高耐旱性植物垫状卷柏为实验材料,基于转录组测序结果,采用RT-PCR技术获得SpLEA1基因cDNA序列,采用HiTail-PCR技术获得启动子序列,利用生物信息学对序列进行了分析,并采用qRT-PCR技术分析了SpLEA1基因在干旱胁迫下的表达模式。结果表明:(1)垫状卷柏SpLEA1全长为476 bp,开放阅读框(ORF)为279 bp,共编码92个氨基酸,通过在线工具预测到蛋白分子量为9 491.46 Da, 等电点为5.45,蛋白结构预测分析表明该蛋白为亲水性蛋白,含有10个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。(2)预测到SpLEA1蛋白的保守结构域为Lea-5,来源于LEA1家族。基于系统发生树和遗传距离矩阵,发现垫状卷柏SpLEA1与来自鹰嘴豆(Cicer arietinum )和红车轴草(Trifolium pratense)的Lea-5蛋白同源性较高。(3)对启动子序列进行顺式作用元件的预测分析发现SpLEA1基因启动子含有5类激素响应元件和与干旱胁迫响应有关的功能元件。(4)在自然干旱处理下SpLEA1基因表达上调,并在12 h时达到峰值,在24 h干旱后进行复水处理,表达量显著下调。综上所述,SpLEA1基因在垫状卷柏中很可能参与了干旱胁迫响应机制的相关调控。该结果为进一步研究垫状卷柏SpLEA1基因在干旱胁迫下的功能及其表达调控机制提供了参考。     

兰科菌根真菌对铁皮石斛光合性能及pepc基因表达的影响

为了阐明兰科菌根真菌对铁皮石斛光合作用的影响及机制,采用盆栽方式研究了兰科菌根真菌对铁皮石斛幼苗生长的影响,并分析了叶片中叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数以及pepc基因表达的变化。结果表明：（1）兰科菌根真菌促进了铁皮石斛幼苗生长,接种兰科菌根真菌的铁皮石斛的株高、根重、茎叶重和总生物量分别是未接种对照组的1.21、1.54、1.71和1.68倍;而且可显著提高叶片中叶绿素含量、叶片净光合速率（P_n）、蒸腾速率（G_s）和气孔导度（T_r）。（2）接种兰科菌根真菌的铁皮石斛叶片潜在光化学效率（F_v/F₀）、最大光化学效率（F_v/F_m）、光化学猝灭系数（q_P）、非光化学猝灭系数（q_N）、实际光化学反应量子效率（Yield）和表观光合电子传递速率（ETR）均高于未接种对照组。（3）菌根真菌能促进pepc基因的表达,增强PEPC活性,提高铁皮石斛叶片的光合碳同化能力。研究表明,菌根的形成可以提高铁皮石斛叶片光合性能和pepc基因的表达水平,促进铁皮石斛幼苗的生长。     

秋石斛钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPK)在植物的生长发育及逆境胁迫方面发挥着重要作用。该研究以秋石斛品种‘水芙蓉’为试验材料,采用 RT PCR方法克隆钙依赖蛋白激酶基因,并对其进行生物信息学分析;采用qRT PCR方法对CDPKs基因在‘水芙蓉’不同组织及不同低温胁迫下的表达情况进行分析,为秋石斛CDPK基因的功能验证以及抗寒分子机制研究奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得了DenCDPK1(GenBank登录号为MZ322902)、DenCDPK2(GenBank登录号为MZ322903)、DenCDPK3(GenBank登录号为MZ322904)基因,序列长度依次为1 934、1 971和2 302 bp,分别编码534、541和536个氨基酸。 (2)序列一致性结果显示,DenCDPKs蛋白质与铁皮石斛相应CDPK蛋白质序列的一致性均高于97%,且DenCDPKs均存在STKc_CAMK结构域和4个EF hand结构域。(3)qRT PCR分析显示,DenCDPK1、DenCDPK2和DenCDPK3基因均在叶中高表达,分别在茎、花、茎中低表达;且‘水芙蓉’叶片中DenCDPK1和DenCDPK2的表达量高于其他3个供试品种;经8 ℃胁迫12 h后,叶片中DenCDPKs的表达量均显著高于对照组(25 ℃条件下),且DenCDPK3的表达量在0 ℃胁迫12 h时达到最高值。(4)常温(25 ℃)下‘水芙蓉’叶片中的相对电导率显著低于其他3个供试品种;经低温(8 ℃、0 ℃)胁迫12 h后,叶片中的相对电导率均显著高于对照组,且随温度的降低呈上升趋势。研究认为,DenCDPKs基因可能参与秋石斛低温胁迫的响应过程,特别是DenCDPK2可能在秋石斛抗寒过程中发挥着重要作用。     

滇水金凤花距发育相关基因ABP的克隆及表达分析

为探究滇水金凤(Impatiens uliginosa)ABP基因的结构和表达特征,该研究以滇水金凤为材料,采用RT-PCR 技术对滇水金凤ABP基因进行克隆,运用DNAMAN和MEGA对其所编码的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR分析ABP基因的时空表达模式。结果表明:(1)滇水金凤ABP基因的cDNA 全长为627 bp,编码208 aa,命名为IuABP基因,其蛋白具有Cupin超家族蛋白的典型结构。(2)同源性分析表明滇水金凤ABP基因的氨基酸序列与喜马拉雅凤仙花(I. glandulifera)、月季(Rose chinensis)、木薯(Manihot esculenta)等物种的同源性均达71%; 系统进化分析表明IuABP与喜马拉雅凤仙花(Impatiens glandulifera)聚为一支,亲缘关系最近。(3)qRT-PCR分析表明IuABP基因在滇水金凤花距发育的3个时期及2个部位均有表达。随着花距的发育,IuABP基因在滇水金凤花距檐部的表达量呈先下降后上升的趋势,在盛花期时达最高,而在花距距部的表达量逐渐下降。以上结果为进一步研究滇水金凤ABP基因在花距发育中的功能及其表达调控机制提供了一定的理论参考。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

梅花2个SVP基因的克隆与表达分析

SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE)是MADS box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)成花转变过程的分子机理,该研究采用RT PCR方法从梅花‘长蕊绿萼’中克隆到2个SVP的同源基因,分别命名为PmSVP1和PmSVP2,并采用荧光定量PCR对2个基因的表达模式进行分析。序列分析表明,PmSVP1和PmSVP2的编码区长度分别为687 和672 bp,分别编码228和223氨基酸。系统进化结果显示,PmSVP1与拟南芥AtSVP以及一些木本植物SVP同源基因聚为一组,PmSVP2与马铃薯、乳浆大戟等草本植物中的SVP同源基因聚为一组。实时荧光定量分析表明,在成年梅花中,2个PmSVP基因主要在茎、叶和叶芽等营养器官中表达,且都在叶中表达量最高。在1月龄幼苗中,PmSVP1基因在根、茎、叶中都有表达,PmSVP2基因则没有任何表达;在梅花花芽分化过程中,PmSVP1和PmSVP2基因的表达量均呈现下调表达的趋势。研究推测,PmSVP1和PmSVP2基因可能参与调控梅花从营养生长向生殖生长的转变。     

铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析

为了解SMT2基因在铁皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇代谢过程中的作用,利用RACE技术克隆到1个DoSMT2基因,开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸,DoSMT2相对分子量为40.345 kD,理论等电点为8.13,属于稳定的亲水性蛋白。经BLAST P检索,DoSMT2蛋白属于AdoMet-MTases超级家族,含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域和1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域。系统进化分析表明,DoSMT2与深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）的SMT2亲缘关系最近,确定其属于SMT2家族。qRT-PCR分析结果表明,DoSMT2基因在茎和叶都能表达,10月份的表达量最高,叶片的表达量显著高于茎,推断叶片的甾醇代谢比茎活跃。构建了pET-29a-DoSMT2原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达出预期大小的蛋白。这为铁皮石斛DoSMT2的甲基化机制及甾醇化合物代谢研究奠定基础。     

小桐子植物特异性酪蛋白激酶PS-CK1-5基因的克隆及原核表达分析

酪蛋白激酶(casein kinase, CK)作为一类普遍存在的Ser/Thr蛋白激酶，通过调节靶标蛋白的活性与稳定性，在植物整个生理过程及信号转导途径中发挥重要作用。基于同源序列比对，该研究对小桐子(Jatropha curcas)酪蛋白激酶基因家族进行鉴定与表达分析。结果表明，小桐子基因组中共鉴定到7个酪蛋白激酶1基因(CK1)、5个植物特异性酪蛋白激酶1基因(PS-CK1)、3个酪蛋白激酶2α亚基基因(CK2-α)、2个酪蛋白激酶2β亚基基因(CK2-β)，4个亚家族成员在氨基酸长度、等电点及外显子数目等都有其家族特异性。蛋白的氨基酸序列比对表明，小桐子酪蛋白激酶1都包含N端保守激酶结构域，同时其内部都鉴定到典型的激酶活性环基序、ATP结合核心基序、核定位信号肽。qRT-PCR表达分析表明，小桐子JcPS-CK1-5基因在叶片与根中都属于低温诱导基因，可能参与小桐子抗冷性过程。构建其原核表达载体pET-32a-JcPS-CK1-5，并在BL21(DE3)中诱导表达，得到81.6 kD的条带，与理论融合蛋白的分子量一致。这可为小桐子CK基因的功能鉴定及逆境信号转导机制研究提供参考。     

铁皮石斛钙网蛋白基因DoCRT1的分子克隆与表达研究

该研究采用RACE克隆铁皮石斛钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因DoCRT1,进行生物信息学分析,并借助定量PCR检测基因表达模式,为揭示该基因在铁皮石斛生长发育及逆境生理中的分子作用奠定基础。结果表明:(1)DoCRT1基因(GenBank登录号KT957551)cDNA全长1 672bp,ORF长1 275bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量49.05kD,等电点4.42,具有CRT蛋白保守的钙网蛋白/钙联接蛋白P结构域(205~320)和类伴刀豆球蛋白凝集素/葡聚糖酶结构域A(20~222)以及多个基序;蛋白N端含有一个信号肽(1~23)和一个跨膜区域(8~24),预测结果显示主要定位于细胞液泡、胞外,与多种植物CRT蛋白一致性很高(80%~87%)。(2)DoCRT1蛋白与OsCRT1/2、ZmCRT1亲缘关系近,聚在CRT进化树的CRT1/2分支。(3)qRT-PCR检测结果显示,DoCRT1基因转录本在石斛根中表达量较高,为叶中的2.23倍,且茎与叶中表达量无显著差异。     

铁皮石斛泛素结合酶DoUBC9的克隆鉴定与表达分析

目的:本研究旨在探讨泛素结合酶UBC9在铁皮石斛原球茎发育过程中的分子机制,方法:利用生物信息学手段,从已获得的铁皮石斛基因组中鉴定出UBC9基因,命名为DoUBC9,并利用RACE技术,克隆出DoUBC9 3’端,通过与基因组序列拼接,获得完整序列。结果:本研究首次从铁皮石斛基因组中运用生物信息学的方法,鉴定出DoUBC9,并通过RACE技术克隆后拼接,得到完整的DoUBC9,基因全长为7176bp,CDS长为447bp,共编码148个氨基酸。亚细胞定位预测结果表明,DoUBC9大概率分布于分泌囊泡和质膜上。序列比对和进化树分析表明,铁皮石斛Do UBC9和其他物种中的UBC9拥有高度保守的UBCc结构域,进化关系高度保守。qRT-PCR分析表明,在不同组织部位中,DoUBC9在愈伤组织中的表达量最高、叶中表达量最小;在原球茎发育过程中,在P1时期具有最高表达量,其他各时期表达量较小,表明该基因可能促进了植物体的细胞快速分裂与生长。结论:通过分子建模方式,首次构建出DoUBC9蛋白的基本模型,并通过不同的评价方式确定了以人泛素结合酶E2 H结构(2Z5D)为模板的为最优模型。     

龙眼体胚发生相关未知蛋白DlUP-3基因的克隆与表达分析

在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中,发现1个体胚发生相关未知蛋白DlUP-3,通过简并引物结合RACE技术进行其基因全长序列克隆。结果显示:(1)克隆到的龙眼体胚发生相关未知蛋白基因DlUP-3的全长cDNA序列为1 681bp,开放阅读框由1 017个核苷酸组成,编码338个氨基酸(GenBank登录号为GQ167202)。(2)生物信息学分析发现,该基因推导蛋白分子量为36 854.2Da,pI为9.05;该蛋白为Ras蛋白质家族成员,具有ATP/GTP-binding site motif A(P-loop)结合位点和1个典型的Ras_like_GTPase superfamily组件,无典型信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。(3)实时荧光定量PCR分析显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其中以胚性愈伤组织阶段表达量最低,而球形胚阶段最高。研究表明,DlUP-3基因在龙眼体胚发生过程尤其是球形胚阶段有重要的作用,为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。     

福建泰宁野生铁皮石斛种群的ISSR亲缘关系分析

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)种质间的亲缘关系,利用ISSR技术对34份铁皮石斛种质资源进行亲缘关系和遗传多样性分析。结果表明,9条ISSR引物在34份种质中共扩增出78条带,多态位点百分率达100%。UPGMA聚类分析表明,种质的相似系数为0.61~0.92,在相似系数0.626处,福建省泰宁的野生铁皮石斛与栽培铁皮石斛分为两大类。泰宁野生铁皮石斛种群的Nei’s基因多样性(H)和遗传分化系数(Gst)分别为0.3111和0.4609,均高于栽培种群(0.3056和0.4204),表明泰宁野生铁皮石斛具有较丰富的多样性和较高的种群分化系数。AMOVA分析表明,铁皮石斛种群内变异指数为74%,种群间变异指数为26%,表明不同种群间可能存在基因交流。这些为不同地域的野生铁皮石斛资源的有效保护及利用提供理论依据及技术参考。     

龙眼体胚发生过程中DCL基因的分子特性及表达分析

从龙眼转录组unigene序列筛选获得龙眼DCL基因(命名为DlDCL)全长序列,并结合生物信息学及实时荧光定量等方法,对龙眼DCL基因进行研究,以明确DlDCLs在龙眼体胚、不同生长组织部位中的表达规律及其对激素和光质应答反应,为进一步研究龙眼体胚过程中DlDCLs基因的调控研究奠定基础。结果表明:(1)龙眼转录组数据存在DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4四个DCL家族成员,且基于Unigene的FPKM值发现不同基因在体胚发生阶段具有差异表达。(2)生物信息学分析发现,DlDCLs成员间基本理化性质较为类似,均为亲水性不稳定蛋白、不含信号肽、可进行跨膜运动,但也存在一定差异,如DlDCL2为碱性蛋白,而其他3个成员为酸性蛋白;亚细胞定位预测显示,DlDCLs均定位于细胞核中,但DlDCL2也存在定位于叶绿体中;对DCL蛋白结构域预测显示,DCL是高度保守的蛋白。(3)系统进化树分析显示,不同物种的DCL分为4个分支,同源的DCL蛋白都聚为一类,且DlDCLs与柑橘DCL亲缘关系更为接近。(4)实时荧光定量PCR分析表明,DlDCLs在龙眼非胚性愈伤组织和体胚发生过程中的表达模式差异较大,但DlDCLs在愈伤组织阶段均有较高的表达量,推测DlDCLs在体胚发生过程可能具有功能的独立和协作。DlDCL1和DlDCL2在叶片、花器官等组织部位中的相对表达量较高,暗示DlDCL1和DlDCL2可能参与到光合作用和花器官的发育;DlDCLs还受2,4-D、MeJA、SA激素和光质诱导,表明DlDCLs可能参与激素和光质调控。     

Detection of a <Emphasis Type="Italic">SERK</Emphasis>-like gene in coconut and analysis of its expression during the formation of embryogenic callus and somatic embryos

Somatic embryogenesis involves different molecular events including differential gene expression and various signal transduction pathways. One of the genes identified in early somatic embryogenesis is S OMATIC E MBRYOGENESIS R ECEPTOR-like K INASE (SERK). Cocos nucifera (L.) is one of the most recalcitrant species for in vitro regeneration, achieved so far only through somatic embryogenesis, although just a few embryos could be obtained from a single explant. In order to increase efficiency of this process we need to understand it better. Therefore, the purpose of the present work was to determine if an ortholog of the SERK gene is present in the coconut genome, isolate it and analyze its expression during somatic embryogenesis. The results showed the occurrence of a SERK ortholog referred to as CnSERK. Predicted sequence analysis showed that CnSERK encodes a SERK protein with the domains reported in the SERK proteins in other species. These domains consist of a signal peptide, a leucine zipper domain, five LRR, the Serine-Proline-Proline domain, which is a distinctive domain of the SERK proteins, a single transmembrane domain, the kinase domain with 11 subdomains and the C terminal region. Analysis of its expression showed that it could be detected in embryogenic tissues before embryo development could be observed. In contrast it was not detected or at lower levels in non-embryogenic tissues, thus suggesting that CnSERK expression is associated with induction of somatic embryogenesis and that it could be a potential marker of cells competent to form somatic embryos in coconut tissues cultured in vitro.     

转录组和代谢组分析瘤菌根菌对铁皮石斛的促生机制

为筛选出促进铁皮石斛(Dendrobium officinale)生长的差异表达基因和差异代谢物,对瘤菌根菌与无菌盆栽铁皮石斛苗共生后形成的侧根根系进行转录组、代谢组和双组学联合分析。结果表明,转录组分析共找到262条差异表达基因富集到了35条通路中,其中内质网蛋白质加工通路途径的差异基因最多,其次为氨基糖和核苷酸糖代谢通路。代谢组分析共检测出194个差异代谢物富集到33个KEGG通路中,其中代谢途径的差异代谢物最多有133个,其次为不同环境的微生物代谢途径的差异代谢物有70个。通过联合分析,有9个差异基因的差异表达导致丝氨酸、谷氨酸、D-甘露糖和激素等代谢物的积累量发生变化,这可能是瘤菌根菌促进铁皮石斛生长的重要原因。因此,推测瘤菌根菌促进铁皮石斛生长与氨基酸、糖、植物激素的积累及相关基因的表达变化有关。     

Rice <Emphasis Type="Italic">SERK1</Emphasis> gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection

Here we report on the isolation and characterization of a somatic embryogenesis receptor-like kinase (OsSERK1) gene in rice (Oryza sativa). The OsSERK1 gene belongs to a small subfamily of receptor-like kinase genes in rice and shares a highly conserved gene structure and extensive sequence homology with previously reported plant SERK genes. Though it has a basal level of expression in various rice organs/tissues, as high expression level was detected in rice callus during somatic embryogenesis. Suppression of OsSERK1 expression in transgenic calli by RNA interference resulted in a significant reduction of shoot regeneration rate (from 72% to 14% in the japonica rice Zhonghua11). Overexpression of OsSERK1, however, increased the shoot regeneration rate (from 72% to 86%). Interestingly, OsSERK1 is significantly activated by the rice blast fungus, particularly during the incompatible interaction, and is associated with host cell death in Sekigushi lesion mimic mutants. This gene is also inducible by defense signaling molecules such as salicylic acid, jasmonic acid, and abscisic acid. Furthermore, constitutive overexpression of OsSERK1 in two rice cultivars led to an increase in host resistance to the blast fungus. Our data suggest that OsSERK1 may partially mediate defense signal transduction in addition to its basic role in somatic embryogenesis.