阳离子脂质体介导的基因转染大鼠BM-EPC的研究

目的:探讨阳离子脂质体法对体外分离培养的Sprague-Dawley(SD )大鼠骨髓来源-血管内皮祖细胞(Bone Marrow-Endothelial progenitorcells,BM-EPCs) 进行基因转染时脂质 体和DNA质粒安全有效的剂量组合.方法:体外分离、培养SD大鼠BM-EPCs ;免疫荧光技术测 定CD34、CD133、Dil-acLDL,对细胞进行鉴定;按照正交设计,用不同水平的脂质体和质粒 pEGFP转染细胞;荧光显微镜下计数阳性转染细胞,计算转染率.结果:SD 大鼠BM-EPCs细胞 表面抗原CD133、CD34呈阳性表达并具有吞噬Dil-acLDL的功能,形态学上两种细胞亚型-早 期及晚期外生EPCs共存于其中.Lipofectamine 2000和pEFGP不同剂量组合均可转染大鼠BM -EPCs,其中脂质体5ìl/质粒8ìg时的转染效率高于二者其它剂量组合(P＜0.05). 结论:优化条件后的阳离子脂质体Lipofectamine 2000可安全、有效转染体外分离培养的SD大鼠BM-EPCs.     

猪肾细胞脂质磁转染系统的构建与表征

磁性纳米基因载体是一种非病毒基因载体,经过功能性基团修饰后能够连接阳离子转染剂构建细胞转染系统。本文将磁转染技术结合常用的脂质体转染,形成了一种新型动物体细胞转染方法,即称脂质磁转染(Liposomal magnetofection,LMF)。这将为体细胞克隆培育转基因动物提供稳定遗传的细胞系。为构建脂质磁性纳米基因载体复合物系统,本研究利用一种磁性纳米基因载体通过分子自组装与脂质阳离子转染剂结合,用于携带外源基因转染动物体细胞。通过原子力显微镜(AFM)观测、ζ电位-粒度等分析表征手段,研究磁性纳米基因载体的形貌、粒径分布、负载及浓缩DNA的方式。结果表明,通过猪肾(PK)细胞的LMF实验,与脂质体(Lipofectamine2000)介导的转染比较,具有较高的转染率,更重要的是克服了脂质体转染瞬时表达的缺陷。MTT细胞毒性试验结果也显示该方法具有较低的细胞毒性。因此LMF是一种切实可行的高效低毒性的细胞转染方法。     

阳离子脂质体对HepG2.2.15细胞病毒分泌、毒性及凋亡的影响

目的:探讨阳离子脂质体作为基因治疗药物载体对HepG2.2.15细胞的病毒分泌、毒性及凋亡的研究.方法:以2.5、5.0、7.510.0 μL/mL浓度的阳离子脂质体转染HepG2.2.15细胞,共温育10 d,ELISA法检测细胞上清中HBsAg和HBeAg含量的变化.转染48 h后,MTT法检测阳离子脂质体对细胞的毒性、荧光显微镜检测细胞凋亡情况.结果:各个剂量组阳离子脂质体对HepG2.2.15细胞均有抑制作用,其中10 μL/mL组在第10 d对HBsAg、HBeAg抑制率分别达31.5%、29.9%,表现出较高的毒性作用.2.5、5.0、7.5 10.0 μL/mL阳离子脂质体转染HepG2.2.15细胞后,MTT检测结果显示其细胞存活率分别为82.14%、77.62%、77.4%、61.9%.荧光显微镜下可见各浓度组均有凋亡,且随脂质体剂量增加细胞凋亡数增加.结论:阳离子脂质体能抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg,其毒性及诱导凋亡作用呈剂量和时间依赖性.作为基因治疗药物载体时,剂量宜小于7.5 μL/mL.     

ARG1基因对人胚肾细胞293砷染毒前后增殖及凋亡的影响

目的:观察ARG1基因对不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)染毒后的293细胞的增殖及凋亡的影响,并讨论ARG1的抗砷性.方法:将ARG1表达质粒pcDNA3.1-ARG1及空载体对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质(Lipofectamine2000)介导转染293细胞后,荧光共聚焦显微镜观察细胞转染率;将实验组pcDNA3.1.ARG1-293细胞、空白对照组pcDNA3.1-293细胞及阴性对照组293细胞用不同浓度的NaAsO2浓度染毒48h后,使用MTT法检测ARG1基因对砷染毒后293细胞的增殖的影响;将实验组、空白对照纽及阴性对照组按不同浓度NaAsO2染毒,加入Annexin V FITC/PI凋亡试剂,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果:(1)荧光共聚焦显微镜观察转染结果显示转染率可达75-85%;(2)NaAsO2在1-8 μ mol/L时其对实验组细胞增值的抑制率明显低于对照组,而在浓度>8μ mol/L时则没有明显差异;(3)实验组细胞在NaAsO2浓度<8 μ mol/L其凋亡率明显低于对照组.结论:ARG1能够降低NaAsO2对293细胞增值的抑制率,减轻其对293细胞的促凋亡作用,主要是在低浓度时发挥作用.     

脂质体介导的人甲状腺过氧化物酶基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达

目的:利用基因转染技术,研究以脂质体Lipofectamine2000为载体介导的人甲状腺过氧化物酶(TPO)基因体外转染肺癌细胞,检测感染细胞内TPO蛋白的表达,为放射性碘治疗肺癌提供理论和实验依据.方法:将获得的含TPO基因的质粒pcDAN3.1-hTPO进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序.将肺癌A549细胞在体外复苏与培养并分为两组:转染质粒peDAN3.1-hTPO的为实验组,转染空质粒pcDAN3.1的为对照组.以脂质体Lipofectamine2000为栽体,介导TPO基因转染肺癌细胞.采用Western Blot免疫印迹法和免疫组化法分别检测肺癌细胞中TPO蛋白的表达.结果:①酶切鉴定和DNA测序结果表明质粒pcDAN3.1-hTPO中插入的基因为hTPO基因,其片段大小和方向正确.②体外培养的肺癌细胞活力及数量正常,细胞活力为96%,细胞生长密度为1× 106/ml,满足实验要求.③质粒转染A549细胞后,Western Blot免疫印迹法显示:在实验组中,肺癌A549细胞有TPO蛋白的表达,而在对照组中无表达.④免疫组化染色结果显示:在实验组的肺癌A549细胞中,TPO蛋白表达阳性且主要分布于细胞膜上,阳性表达率可达75%,而在对照组中TPO蛋白表达阴性,两组比较差异有显著性(P=0.000).结论:①获得的hTPO基因片段的核苷酸序列与GeneBank报道完全一致.②在脂质体Lipofectamine2000的介导下,TPO基因能够有效地转染肺癌细胞.③转染人甲状腺过氧化物酶基因的肺癌细胞能够在体外成功地表达TPO蛋白.     

磁性纳米颗粒作为基因转染载体的研究

通过扫描电子显微镜和Zeta电位仪对磁性纳米颗粒的形貌、粒径、表面电位等进行了表征。利用凝胶电泳阻滞试验分析磁性纳米颗粒与DNA的结合情况,研究磁性纳米颗粒对DNA的保护效果,运用MTT和流式细胞术分析磁性纳米颗粒对细胞的毒性。以绿色荧光蛋白基因为报告基因进行293T细胞的转染,研究磁性纳米颗粒与质粒DNA不同比例条件下对293T细胞的转染效率,并与脂质体(Lipofectamine2000)介导的转染进行比较分析。结果表明,磁性纳米颗粒与DNA可以稳定结合,可以保护DNA免受酶的消化作用,当磁性纳米颗粒与DNA比为1 1时,转染效率最高,优于脂质体(Lipotamine2000)介导的转染,且对细胞的毒害作用小于Lipotamine2000。     

阳离子脂质体介导基因转染肿瘤细胞

使用基因转运载体运载肿瘤细胞进行转染是基因治疗的关键环节之一。Lipo-fectamine2000和DOTAP作为商品转染试剂,具有较高的转染效率。为了进一步发掘其作为基因转运载体的应用潜力,该文研究了Lipofectamine2000和DOTAP的粒径、Zeta电位及形态,并分别与绿色荧光蛋白基因（pGFP—N2）、荧光素酶基因（pGL3）结合,形成脂质体／DNA复合物,通过载入人喉癌细胞（Hep-2）和人肺癌细胞（NCI—H460）,考察了其转染效率和细胞毒性。结果表明,脂质体Lipofectamine2000与DOTAP都能有效压缩DNA,形成复合物。Lipofectamine2000与DOTAP井目比,转染效率高,与DNA最佳转染比例范围为2：1～4：1。毒性实验显示,在N／P大于3／l时,Lipofectamine2000与DOTAP对癌细胞具有一定的细胞毒性。细胞种类对脂质体的转染效率有很大影响,Lipo—fectamine2000对Hep－2细胞的转染效率比NcI—H460高。     

优化脂质体对肝癌细胞株HepG2细胞转染效率

摸索用Lipofectamine 2000(Lipo)转染质粒pEGFP-C1到肝癌细胞HepG2较为合适的转染条件。以HepG2细胞为研究对象,采用脂质体Lipofectamine 2000转染pEGFP-C1质粒,在24孔板先按每孔0.5μg固定pEGFP-C1质粒用量,摸索Lipo在1μL、1.5μL、2μL、2.5μL量上较为合适的用量,确定Lipo用量后,然后固定Lipo为1μL,摸索质粒用量0.5μg、1μg,确定脂质体与质粒的最佳比例。此外,对转染中培养基是否含血清,Lipofectamine 2000与pEGFP-C1质粒比例为1:0.5的基础上,扩大用量,即Lipofectamine 2000 2μL和pEGFP-C1质粒1μg,以及脂质体复合物孵育细胞时间进行优化。最后,采用荧光倒置显微镜观察细胞转染效率和方差分析及秩和检验的统计学方法进行统计分析。结果显示,pEGFP-C1质粒固定为0.5μg时,Lipo用量在1μL及1.5μL用量组转染效率最好,之后随着Lipo用量加大,转染效率下降;固定Lipo用量1μL,pEGFP-C1质粒0.5μg时转染效率最好(p0.05),比例不变,扩大Lipo和质粒用量,并不增加转染效率。转染后于3 h、6 h、8 h、12 h、24 h换成正常培养基培养,转染6 h后换液较好。此外,研究发现培养基是否含血清不影响转染效率。本研究表明在24孔板板中用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞时较为合适的转染条件为每孔1μL Lipofectamine 2000和0.5μg质粒,脂质体与质粒的最佳比例为2:1,血清不影响转染效率,用含血清培养基转染后6 h换液培养。     

胆固醇嵌入式阳离子脂质体运载基因研究

阳离子脂质体是一种有临床应用潜力的抗肿瘤药物递药系统,助类脂能起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性类脂的细胞渗透功能。为了进一步发掘助类脂的应用潜力,该文采用胆固醇(cholesterol)作为助类脂制备阳离子脂质体,测定了脂质体的粒径及Zeta电位,脂质体的平均粒径为100~140 nm,Zeta电位为45~60 mV。脂质体分别与绿色荧光蛋白基因(pGFP-N2)、荧光素酶基因(pGL3)结合,形成脂质体/DNA复合物,通过载入人喉癌细胞(Hep-2),考察了其转染效率和细胞毒性。结果表明,阳离子类脂与胆固醇以1:1、1:2和1:4摩尔比例混合制备脂质体均能高效转染Hep-2细胞。毒性实验显示,阳离子类脂单独存在时对癌细胞具有一定的细胞毒性,随着胆固醇的加入,脂质体对细胞的毒性明显减小,与商品试剂DOTAP和Lipofectamine 2000相当。     

阳离子脂质体介导基因转染的最优化条件

阳离子脂质体介导基因转染的最优化条件王瓞林其谁（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,上海２０００３１）关键词阳离子脂质体基因转染表达真核细胞阳离子脂质体转染的重要参数有：脂质体浓度和ＤＮＡ的浓度、细胞密度以及脂质体－ＤＮＡ复合物与细...