生防放线菌Ahn75的荧光标记及其在水稻中的定殖

【背景】目前gfp标记基因已成为研究靶标微生物与宿主之间互作的一种重要工具。利用gfp基因标记生防菌株,可以对生防菌株的生存及定殖能力进行有效追踪。【目的】对生防放线菌Ahn75进行荧光标记,探讨其在水稻中的定殖规律,为研究Ahn75的稻瘟病防治机制奠定基础。【方法】首先通过电激转化将含绿色荧光标记基因(gfp)的质粒pIJ8655导入大肠杆菌ET12567中,然后采用接合转移的方法将gfp整合到Ahn75基因组上;通过平板对峙试验检验Ahn75-GFP在标记绿色荧光后对稻瘟病病原菌的抑菌活性;采用喷施孢子液的方式将带荧光标记的Ahn75-GFP定殖水稻,并利用荧光显微镜观察生防菌在水稻中的定殖情况;对定殖水稻中的内生菌进行重分离,探究菌株在水稻组织中的分布规律。【结果】PCR扩增和荧光观察表明,绿色荧光标记基因成功整合到生防放线菌Ahn75中。通过平板对峙试验,发现Ahn75-GFP对稻瘟病病原菌抑菌活性与原始菌株没有显著差别。在荧光显微镜下,可以观察到Ahn75-GFP能稳定定殖于水稻的根、茎、叶等组织中,而水稻内生菌重分离试验表明该菌株在茎中的定殖力最强。【结论】获得一株绿色荧光标记生防菌株Ahn75-GFP,结果显示该菌株定殖水稻效果良好,这对于研究Ahn75的稻瘟病防治具有重要意义。     

用gfp基因标记法研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖结瘤情况

采用三亲本杂交的方法,将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入高效、抗逆、广适应性的快生大豆根瘤菌Sinorhizobium frediiCCBAU 01287中,获得含gfp基因的转基因菌株CBAU 01287(G);平板传代和共生检测表明:外源质粒在CCBAU 01287中能够自我复制,稳定遗传。进一步研究表明,gfp标记菌CCBAU 01287(G)可用于实时监测根瘤菌在大豆根部的早期定殖情况和定殖密度的测定;标记菌株对大豆的生长及生物量的积累与出发菌株的效果无显著差异。     

PF40 的亚细胞定位研究

pf40 基因是从谷子未成熟种子 cDNA 文库中获得的,与水稻、拟南芥的离子通道蛋白同源性很高 , 具有 8 个跨膜区 . 该基因转入烟草,可使烟草分枝增多,将其转入谷子,可使谷子分蘖增多 . 构建 pf40 与绿色荧光蛋白 gfp 的融合基因,转入烟草进行稳定表达,通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察研究其亚细胞定位,发现荧光主要集中在内质网 . 将 pf40 不同缺失区段的 4 个片段与 gfp 构建融合基因,转入烟草进行稳定表达,发现 PF40 N 端 93 个氨基酸残基就能够使得 PF40 定位在内质网, C 端缺失没有影响蛋白质的亚细胞定位 .     

含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达

本文用绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein）标记水稻白叶枯细菌,观察其在白叶枯细菌中的表达情况。光激发后,白叶枯细菌发出绿色荧光,表明gfp在白叶枯细菌中得到了高效表达。后续工作意在利用gfp所发出的绿色荧光,来追踪白叶枯细菌侵染水稻的路径,以及检测水稻在遭受白叶枯病害时的一些生理生态变化,进一步探讨水稻对白叶枯细菌的抗生机理,希望能够为水稻抗性品种的检测提供新的理论依据。文中重点介绍了对质粒pM2464的改造过程,经gfp标记后的水稻白叶枯细菌,在紫外或蓝光的激发下,发出绿色荧光,证明了用标记有gfp基因的白叶枯细菌来观察其侵染水稻过程的想法是可行的。     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。     

基于PEG介导原生质体转化构建粉红聚端孢荧光标记

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌。本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg。选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强。与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达。本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究。     

绿色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

根据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的特性,将GFP作为目的基因,与穿梭载体p HY300PLK结合,构建一个芽孢杆菌WB600的蛋白表达体系,为在枯草芽孢杆菌中表达其他蛋白提供了一定的技术和理论支持。本文结合p HY300PLK的克隆位点,设计gfp基因的引物,PCR扩增后回收的gfp基因片段进行双酶切,与相同双酶切的pHY300PLK连接获得pHY300PLK-GFP,通过电转化将pHY300PLK-GFP转化至芽孢杆菌WB600中并检测。获得转化子WB1,检测到转化子在荧光显微镜下显示绿色荧光,且后续测序检测表明重组质粒构建成功。     

特异性杀虫基因Bt cry3A在桑粒肩天牛幼虫两种肠道常驻内生菌中的转化和表达

[目的]将特异性杀虫毒蛋白基因Bt cry3A转入桑粒肩天牛(Apriona germari Hope,Ag)幼虫肠道常驻内生菌中,构建能在天牛幼虫肠道中定殖并表达特异性杀虫基因Bt cry3A的工程菌.[方法]以传统方法和16S rDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定Ag幼虫肠道优势的常驻内生菌,从中筛选出适合转化的候选菌株.利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力Bt cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305a和pHT7911分别转入Ag幼虫肠道常驻内生菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis Ag12,Ag12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Ag13,Ag13)中.[结果]从Ag幼虫肠道共分离获得18个不同种的可培养细菌菌株,并从中选取菌株Ag12和Ag13作为出发菌株转入Bt cry3A基因.经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试、伴胞晶体电镜检测、毒蛋白SDS-PAGE分析、工程菌定殖性分析以及生物毒力测试,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的常驻内生菌短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中,并且工程菌Ag12-305a、Ag13-305a、Ag 12-7911和Ag13-7911都能在天牛幼虫肠道内稳定生长、繁殖并表达分子量约65kDa的伴孢晶体杀虫蛋白Cry3A.[结论]Bt cry3A基因已成功转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势常驻内生菌中,获得了四株能在桑粒肩天牛幼虫肠道内定殖,并能表达目的杀虫基因Btcry3A的转基因工程菌.     

银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立

银耳（Tremella fuciformis）属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢．银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点．本研究以gpd—Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pG1g—gfp和pG1q—hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg／mL;采用电击法把pG1q—hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为：STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1．0×10^8个／mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2．0kV／cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个／μg DNA．采用最佳电击参数把质粒pG1g—gfP和pG1g—hph按1：1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37．5％．这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达．     

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示b-1, 3-1, 4-葡聚糖酶

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA, 通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp, 再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137, 然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137。经SDS-PAGE检测, 重组菌MB137可表达预期的分子量约74 kD的蛋白质。Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组菌细胞表面, 被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%。进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的b-1, 3-1, 4葡聚糖酶基因gls, 来取代pMB137中的gfp, 得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138, 经导入到乳酸乳球菌AS1.2829后得到重组菌MB138, 其全细胞b-1, 3-1, 4-葡聚糖水解酶的活性约为12 U/mL菌液, 明显高于对照菌株。     

农杆菌介导的胀果甘草愈伤组织遗传转化

目的:旨在建立一个农杆菌介导的甘草愈伤组织遗传转化的可行方案,并对转化条件进行优化。方法:选择EHA105和LBA4404两种根癌农杆菌菌株,热激法转入含有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体pBI121-gfp,挑选转化的农杆菌用于侵染胀果甘草愈伤组织。设置不同培养时间的愈伤组织作为受体材料和农杆菌不同侵染时间两组条件,经共培养后的甘草愈伤组织进行荧光检测。结果:愈伤组织在含有100mg/l卡那霉素的继代培养基上进行筛选培养,得到了具有卡那霉素抗性的转化甘草愈伤组织,转化愈伤组织经继代培养基后在紫外光下仍可见绿色荧光,PCR检测转化愈伤组织基因组中含有gfp基因。结论:试验建立了农杆菌介导的甘草愈伤组织的遗传转化体系,为目的基因导入甘草细胞利用基因工程手段调控甘草次生代谢产物生物合成的研究奠定了基础。     

表达增强绿色荧光蛋白重组乳酸菌的构建

以乳酸乳球菌通用表达载体pMG36e为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入该载体组成型表达强启动子p32的下游,构建了eGFP标记的乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP。重组质粒电击转化一株乳酸乳球菌BLCC02-0018。筛选阳性转化子,通过连续荧光强度检测,验证eGFP基因能否在重组菌中稳定表达。重组表达质粒pMG36e-eGFP酶切及测序结果与预期片段大小相符,表明成功构建了重组乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP;对阳性转化子进行蓝光激发,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30代仍可见荧光,结果表明已经成功构建表达增强型绿色荧光蛋白的重组乳酸乳球菌,为下一步研究乳酸菌在动物体内的分布定殖规律打下了基础。     

以gfp为报告基因的肺炎链球菌启动子诱捕文库的构建与分析

首先构建一个以gfp(green fluorescence protein)为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP,将肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200bp～800 bp)克隆到该质粒gfp基因上游的多克隆位点,得到约58000个含有肺炎链球茵基因组DNA随机酶切片段的重组子,提取质粒即为质粒库,该库大约覆盖肺炎链球菌基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,且有较强的随机性,质量较高.将该质粒库转化入肺炎链球菌TIGR4菌株,带有随机片段的报告质粒通过同源重组的方式将gfp基因融合于细菌染色体上该随机片段之后,利用质粒的抗生素抗性基因筛选出重组菌株,从而构建出相应的菌株库,共获得包含约500000个肺炎链球菌转化子的菌株库,经体内、外实验表明,其包含插入了S.pn体内、外表达基因片段的细菌,可以报告特定条件下的基因表达,并可通过流式细胞仪识别、分选.该文库的构建为进一步利用差异荧光诱导技术筛选肺炎链球菌体内诱导基因奠定了基础.     

蛹虫草hat启动子的克隆及功能分析

从蛹虫草中克隆出1个组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase)基因的hat启动子,长度为1 509 bp,并对该启动子的序列进行详细分析。依据作用元件预测结果显示,hat启动子含有CAAT-box和TATA-box等典型的顺式作用元件,以及参与光响应的顺式作用元件G-box,参与水杨酸响应的顺式作用元件SARE等。将hat启动子连接于报告基因绿色荧光蛋白基因gfp (Green fluorescence gene)的上游,与gfp融合基因表达构建来鉴定启动子的活性。经过农杆菌转化,得到的疑似转化子进行PCR验证、gfp表达水平分析及荧光检测,结果表明：该启动子在蛹虫草菌丝中有较强的驱动GFP表达的能力,在荧光显微镜下可以观察到转化子具有强烈的绿色荧光。开展此研究为食用菌菌种改造提供启动子元件及建立高效的蛹虫草异源基因表达体系奠定基础。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统.我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155.将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象.板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料.     

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用北大核心CSCD

扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列,与lacZ基因融合得到p HM1:P_(RiPAK)LacZ。携带pHM1:P_(RiPAK)LacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性,表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体,把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5,使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达;构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状,青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响,将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处,可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记,标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。     

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用

扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列,与lacZ基因融合得到p HM1:P_(RiPAK)LacZ。携带pHM1:P_(RiPAK)LacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性,表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体,把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5,使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达;构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状,青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响,将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处,可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记,标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。     

水稻内生优势成团泛菌GFP标记菌株的性质与标记丢失动力学

为研究内生细菌对宿主植物侵染定殖的机理和其共生生物学作用 ,对水稻内生优势成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)YS19与绿色荧光蛋白 (GFP)标记的YS19B ::gfp菌株的生长动力学进行了比较研究 ,探讨了成团泛菌YS19B ::gfp的标记稳定性和荧光性质 .标记菌株与野生型菌株相比 ,最大比生长速率和最大生物量仅减小 12 4 %和 6 % ,代时延长 14 0 % .成团泛菌YS19B ::gfp在指数期连续传代培养 10 0代后 ,GFP标记的保持率为 89 1% ,建立了标记菌株在有标记丢失存在时的生长动力学模型 :dX+ dt =μ+ (1-p)X+ ,解析出细胞分裂时标记丢失的概率p =9 75 6× 10 -7,确定了方程的模型参数 .标记菌株的荧光光谱在激发波长为 4 0 0nm时 ,最大发射波长为 5 0 8nm ,与供体菌株完全相同 .在LB培养基上生长时 ,成团泛菌YS19B ::gfp的GFP产生时间在指数期末期到稳定期较快 ,并于培养至 2 0h时达到最高 ,同时单位菌体生物量的荧光强度也达到最大 .结果说明 ,在GFP标记后成团泛菌YS19B ::gfp的生长仅受到较小影响 ,不致对成团泛菌的生理活动造成大的改变 ,同时由于该菌对宿主的侵染能力比其它内生细菌要强得多 ,因而该菌对植物的侵染活性影响也较小 ,该菌仍然可以保持其内生优势地位 .该标记的稳定性比较高 ,荧光产生正常 ,很适     

绿色荧光蛋白gfp基因在钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株中的表达

将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株在24℃培养,经2 mmol/L的EDTA预处理24 h;采用功率300 W的超声波处理70 s获得单细胞样品,以本实验室构建的携带gfp基因的质粒p215t转化A9藻株单细胞藻液,利用Amp作为选择标记,使单细胞在平板上再生长出单藻落,获得17株具有Amp抗性的转化藻株,转化率3.73‰。在390 nm紫光激发下,生长30天的转化藻丝体发出稳定绿色荧光;培养45天后具有绿色荧光的藻丝出现断裂、具有荧光藻丝长度缩短的现象。实验结果初步表明:报告基因gfp在螺旋藻中得到稳定有效的表达,可以采用单细胞再生形成单藻落技术进行螺旋藻的基因克隆。