一株产虫草素的冬虫夏草内生真菌Bionectria ochroleuca OS17（英文）

虫草素是一种核苷类似物,具有多种药理作用。利用虫草素产生菌发酵的方式获得虫草素,可能是产生虫草素的一种新方法。为筛选能产虫草素的内生真菌,从中国传统的中药冬虫夏草子实体中共分离得到42株真菌,经PDB液体培养后,采用高效液相色谱(HPLC)鉴定其代谢产物。结果表明:菌株OS17的代谢产物中含有虫草素,且虫草素产量为40.16 mg/L。基于形态学特征和ITS序列分析,菌株OS17被鉴定为淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)。这是首次从冬虫夏草中分离得到能产虫草素的生赤壳属,表明了内生真菌具有产生多种生物活性物质的潜力。     

云南嵩明大哨天然虫生真菌及其内生真菌的分离鉴定与抑菌活性分析

【背景】云南存在着丰富的虫草资源,天然虫草群落中蕴藏多样的真菌资源,是挖掘新型抑菌活性化合物的潜在来源。【目的】了解云南嵩明大哨天然虫生真菌及其内生真菌的物种多样性,并从中筛选具有抑菌活性的菌株。【方法】采用组织分离法对所采集的野生虫草样本进行虫生真菌及其内生真菌的分离,并通过形态观察和ITS联合nrSSU、nrLSU、tef-1α、rpb1、rpb2多基因测序进行物种鉴定及多样性分析;通过平板对峙法以7株病原细菌、5株植物病原真菌为病原指示菌进行抑菌活性测试。【结果】共采集86份天然虫草样本,经鉴定隶属于3科5属7种,包括虫草科（Cordycipitaceae）虫草属（Cordyceps）（1种）、白僵菌属（Beauveria）（2种）、鳞翅虫草属（Samsoniella）（2种）、麦角菌科（Clavicipitaceae）泛普可尼亚属（Metapochonia）（1种）,以及线虫草科（Ophiocordycipitaceae）线虫草属（Ophiocordyceps）（1种）。同时,从采集到的虫草样本中分离得到26株内生真菌,分属于9科9属,其中木霉属（Trichoderma）（38%）和镰刀菌属（Fusarium）（19%）为此次分离得到的优势菌属。对所分离保存的真菌按其分离源及种类归属,从虫生真菌和内生真菌菌株中共挑取20株代表性菌株进行抑菌活性筛选,有11株真菌对2株及以上病原指示细菌具有不同程度的抑菌活性,13株真菌对1株以上植物病原真菌具有不同程度拮抗能力;其中Trichoderma sp.Y3-1和Fusarium sp.WZ3-1具有广谱抑菌活性。【结论】云南嵩明大哨分布有丰富的虫生真菌及内生真菌资源,分离所得的真菌对多种病原菌具有不同程度的抑制作用。本研究丰富了云南虫草资源多样性,为云南省虫草及其内生真菌资源的开发利用提供了数据支持,也为下一步从虫草及其相关真菌资源中挖掘抑菌活性物质提供了菌株资源。     

真菌代谢产物的药物发现——资源、问题和策略

本期菌物学报“真菌生物活性代谢产物的药物发现专刊”刊登了7篇深度论述的综述性文章,19篇研究论文及2篇简报。内容涉及植物内生真菌产紫杉醇/紫杉烷的研究现状及最新进展、虫草菌素产生菌的培养策略及其药理学研究进展、灵芝三萜和胞外多糖生物合成的调控策略、淡水和海水真菌活性代谢产物研究进展等。本期内容还涉及内生真菌的分离和鉴定、海洋真菌的代谢产物分离、大型真菌的培养、代谢产物的分离及其药理学研究、酚类化合物测定方法、蛋白质组学以及生物转化等研究,基本体现了我国真菌代谢产物新药发现研究的最新进展,对真菌代谢产物合成调控、活性代谢产物分离和结构鉴定以及药理学研究等都具有重要的参考价值。     

芍药内生真菌的鉴定及产生活性次生代谢产物的评估

【目的】研究药用植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)内生真菌的种群多样性,同时对其可能存在的聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)和非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因多样性进行评估,预测芍药内生真菌产生活性次生代谢产物的潜力。【方法】采用组织分离法获得芍药根部内生真菌菌株,结合形态学特征和ITS序列分析,进行鉴定;利用兼并性引物对内生真菌中存在的聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列测定分析,构建系统发育树,明确芍药内真菌PKS基因序列和NRPS基因序列的系统进化地位。【结果】从芍药组织块中共分离得到105株内生分离物,去重复后获得52株内生真菌,菌株ITS基因序列信息显示,52株芍药内生真菌隶属于7目、13科、15属,其中小球腔菌属(Leptosphaeria)、土赤壳属(Ilyonectria)和镰孢属(Fusarium)为优势种群;从52株内生真菌中筛选获得13株含PKS基因片段的菌株,8株含NRPS基因片段的菌株,部分菌株功能基因的氨基酸序列与Gen Bank中已知化合物的合成序列具有一定的同源性,预示芍药根部内生真菌具有合成丰富多样的次生代谢产物的潜力。【结论】药用植物芍药根部具有丰富的内生真菌资源,且具有产生活性次生代谢产物的潜力,值得进一步开发研究和应用。     

马尾松内生真菌产油脂菌株的分离、筛选和鉴定

采用组织块法从马尾松(Pinus massoniana Lamb.)根、茎和叶片中分离获得内生真菌,初步筛选出产油脂菌株且对其油脂含量进行了分析;并采用形态学及分子生物学方法对产油脂菌株进行了分类鉴定。结果显示:从马尾松植株中共获得21株内生真菌菌株,其中分离自根、茎和叶片的菌株分别为4株、6株和11株。有14株菌株的菌丝中有油滴;其中,分离自叶片的菌株ZP-1、分离自根的菌株ZP-2和分离自茎的菌株ZP-3的菌丝内油滴较多且油脂含量较高,平均油脂含量分别达到29.12%、25.03%和30.56%,差异极显著(P<0.01)。不同菌株的菌落颜色、菌丝和分生孢子形态特征明显不同,菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的形态分别与拟青霉属(Paecilomyces Bainier)、生赤壳菌属(Bionectria Speg.)和镰刀菌属(Fusarium Link)菌种的形态相似。与GenBank中相关真菌ITS序列的比对以及NJ系统树分析结果显示:菌株ZP-1与拟青霉属、菌株ZP-2与生赤壳菌属、菌株ZP-3与镰刀菌属间的ITS片段序列相似性均达到99%,在各自的NJ系统树上它们也分别聚在一起。初步确定菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3分别属于拟青霉属、生赤壳菌属和镰刀菌属。     

新疆胀果甘草内生菌的分离及产甘草酸菌株的筛选

目的：从甘草植株中分离其内生菌,并从中筛选出1株可以产甘草酸的菌株。方法：用PDA和LB等培养基,通过组织分离法和研磨分离法从甘草的根、茎、叶中分离甘草内生菌,将分离的内生菌发酵培养,其发酵液经薄层层析初筛及高效液相色谱定性及定量检测来获得产甘草酸的内生菌。结果：分离到237株甘草内生菌,其中129株为细菌,经鉴定属于13个属;108株为真菌,根据其形态特征,确定属于6个属。获得1株产甘草酸的内生菌,产量可达0.22mg/L。结论：甘草内生菌具有丰富的生物多样性,并能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物。     

北桑寄生内生真菌的分离及其次级代谢产物分析

首次对药用植物北桑寄生叶片中的内生真菌进行分离纯化,从中筛选出具有较高生物活性的菌株,鉴定此菌株并对其次级代谢产物进行初步分离。采用组织块法分离内生真菌,对其进行抗氧化活性和抑菌活性筛选;通过形态学和分子生物学方法鉴定其种属;运用柱色谱、重结晶等方法分离次级代谢产物,波谱学鉴定其结构。从北桑寄生叶片中分离纯化得到29株内生真菌,检测得到一株具有较高抗氧化和抑菌活性的菌株,鉴定为Alternaria alternata,从该菌次级代谢产物中首次分离得到3个单体化合物,分别为alternariol-5-O-methyl ether(1)、alternariol(2)、cis,cis-9,12-octadecadienoic acid(3)。化合物1和2具有较弱的抗氧化活性,化合物1和3表现出一定的抑菌活性。     

蛇足石杉中产石杉碱甲内生真菌的分离和鉴定

【目的】从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)中分离筛选产石杉碱甲的内生真菌。【方法】采用薄层层析及高效液相色谱法对内生真菌代谢产物进行测定和分析以期分离获得产石杉碱甲菌株,运用形态及ITS序列分析方法对产石杉碱甲菌株进行鉴定,并利用连续传代方法考察菌株遗传稳定性。【结果】经筛选获得一株产石杉碱甲内生真菌NSH-5,经形态学鉴定及ITS序列分析鉴定为轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides),其石杉碱甲产量为11.76 mg/100 m L,菌株经20次连续传代后遗传稳定。【结论】NSH-5菌株为一株具有产石杉碱甲能力的轮枝镰孢菌,该菌株的发现为生物合成石杉碱甲提供了新的菌种资源。     

药用植物内生真菌研究进展

药用植物内生真菌具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性,能够产生植物生长素、细胞激动素、赤霉素等促植物生长物质促进植物生长,从而使研究药用植物内生真菌成为寻找新型拮抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性药物的重要资源。本文对药用植物内生真菌的多样性、分离鉴定、产生的次生代谢产物及其功能等做一综述。     

云南三个地区马铃薯内生真菌多样性研究

为研究云南马铃薯(Solanum tuberosum)内生真菌的多样性,该文以采自云南省德宏芒市、大理喜洲和临沧双江3个地区的马铃薯植株为研究对象,采用组织块分离法、尖端菌丝挑取法对马铃薯根、茎及块茎中的内生真菌进行分离纯化,并采用形态学鉴定方法和ITS序列分析法对分离得到的内生真菌进行鉴定,对内生真菌的定殖率、分离率及多样性指数进行计算和分析。结果表明:(1)共分离得到内生真菌98株,其中从德宏芒市的样品中获得40株,从大理喜洲的样品中获得27株,从临沧双江的样品中获得31株。(2)经鉴定,分离得到的马铃薯内生真菌共涵盖10目10科13属,大多为子囊菌门和担子菌门,优势菌为镰刀菌属(Fusarium)和青霉属(Penicillium),褶皱裸孢壳(Emericella rugulosa)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、毛韧革菌(Stereum hirsutum)、Psathyrella sulcatotuberculosa和Epicoccum catenisporum 5种真菌均为首次从马铃薯植株中分离得到。(3)马铃薯块茎内生真菌的定殖率最高,根部内生真菌定殖率最低; 内生真菌的分离率以马铃薯根部为最高,而茎部最低; 不同组织中内生真菌的多样性指数趋势均为根>块茎>茎。从综合来看,云南马铃薯植株中的内生真菌具有较高的多样性,不同地区的马铃薯样品中内生真菌优势菌不同,马铃薯根部具有最丰富的内生真菌种群和最高的分离率,是最适合进行内生真菌分离的材料。该研究结果为后期探究马铃薯内生真菌对病原菌的拮抗作用奠定了基础,也为马铃薯内生真菌多样性研究提供了参考数据。     

Biological control of crown rot of bananas with Pichia anomala strain K and Candida oleophila strain O

The antagonistic activity of two yeast strains (Pichia anomala (E.C. Hansen) Kurtzman, strain K and Candida oleophila Montrocher, strain O) against the parasitic complex responsible for banana crown rot was evaluated. The strains were applied at three different concentrations (10⁶, 10⁷, 10⁸ cfu/ml) and their efficacy tested in vivo on three separate fungi (Colletotrichum musae (Berk. & Curt.) Arx, Fusarium moniliforme Sheldon, and Cephalosporium sp.) and on a parasitic complex formed by association of these three fungi. At the concentrations used C. musae appeared to be the most pathogenic. The complex showed intermediate aggressiveness between C. musae and both other fungi.Statistically significant antagonistic effects were observed on C. musae, F. moniliforme, and the fungal complex. The highest protection level (54.4%) was observed with strain O added at 10⁸ cfu/ml on crowns previously inoculated with the fungal complex. The level was lower when the fungi were inoculated separately.Furthermore, the antagonistic effect was strongly reinforced when strain O at 10⁸ cfu/ml was applied 24 h before fungal complex inoculation (59.9%), as compared to its application 15 min (24.3%) or 3 h (27.3%) after fungal complex inoculation. Bananas showed increased susceptibility to the fungal complex from March to June, and this influenced the level of protection by yeast, which decreased over the same period. A strict negative correlation (R² = 0.83) was highlighted between susceptibility of banana to crown rot and protection provided by yeast.     

带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定

为获得带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子萌发的共生真菌,采用原地共生萌发技术获得了2株自然萌发的小幼苗,并分离和筛选出了有效的种子萌发共生菌——瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)。为验证分离菌株对带叶兜兰种子萌发的有效性,将Phs34号菌株与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验,结果表明,经过6周的培养,对照组没有观察到种子的萌发;接菌的种子胚明显膨大,突破种皮,形成原球茎,平均萌发率为(58.35±3.41)%。这表明分离得到的瘤菌根菌能促进带叶兜兰的种子萌发。     

Evaluation of Beauveria bassiana and B. brongniartii strains and four wild-type fungal species against adults of Bactrocera oleae and Ceratitis capitata

The virulence of two isolates of the hyphomycete fungi, Beauveria bassianaand B. brongniartii, and additional fungal species isolated from diseased Bactrocera oleae pupae and Sesamia nonagrioideslarvae were assessed against adults of the olive fruit fly B. oleae and the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Contact and oral bioassays revealed that moderate to high mortality rates for the olive fruit fly occurred when the adults were exposed to conidia of Mucor hiemalis, Penicillium aurantiogriseum, P. chrysogenum and B. bassianaisolates. A strain of M. hiemalis isolated from S. nonagrioides larvae was the most toxic resulting in 85.2% mortality to the olive fruit fly adults. B. brongniartiiand B. bassiana were the most pathogenic to the C. capitataadults causing 97.4 and 85.6% mortality. Metabolites collected from the M. hiemalis and P. chrysogenum isolates were toxic to adults of both species.     

Diversity and distribution of fungal foliar endophytes in New Zealand Podocarpaceae

The diversity and distribution of fungal endophytes in the leaves of four podocarps (Dacrydium cupressinum, Prumnopitys ferruginea, Dacrycarpus dacrydioides, and Podocarpus totara, all Podocarpaceae) and an angiosperm (Kunzea ericoides, Myrtaceae) occurring in close stands were studied. The effects of host species, locality, and season on endophyte assemblages were investigated. Host species was the major factor shaping endophyte assemblages. The spatial separation of sites and seasonal differences played significant but lesser roles. The mycobiota of each host species included both generalist and largely host-specialised fungi. The host-specialists were often observed at low frequencies on some of the other hosts. There was no clear evidence for family-level specialisation across the Podocarpaceae. Of the 17 species found at similar frequencies on several of the podocarp species, 15 were found also on Kunzea. Many of the endophytes isolated appear to represent species of fungi not previously recognised from New Zealand.     

广陈皮外源真菌的组成及产毒真菌分析

[背景]广陈皮为药食同源中药材,在高温、高湿且贮存不当的条件下容易发霉,从而产生毒素,严重威胁陈皮的质量安全.[目的]分析广陈皮表面外源真菌的组成及其产生毒素的真菌.[方法]采用平板稀释法分离广陈皮表面外源真菌,利用分生孢子形态特征及DNA序列分析进行真菌鉴定,采用高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用技术对青霉属和曲霉...     

白及内生真菌多样性研究

白及( Bletilla striata)是兰科地生型多年生植物,也是我国传统中药材之一。利用菌根技术进行白及的保护和人工栽培,需要获得白及可培养的内生真菌。该研究以广西野生的白及根和叶为材料,采用分离培养法分离内生真菌,并结合真菌形态特征,及其核糖体的转录间隔区( ITS)序列分析,确定内生真菌的分类地位。结果表明：从2株白及植物90块组织中分离获得37株内生真菌,鉴定为15个分类单元,由9个属组成,分属于2门4纲7目8科,包括锤舌菌纲( Leotiomycetes)、座囊菌纲( Dothideomycetes)和粪壳菌纲( Sordariomy-cetes),伞菌纲( Agaricomycetes)。从根中分离获得内生真菌12种,蜡壳菌属为优势属;从叶中分离获得内生真菌3种,刺盘孢属为优势属;刺盘孢菌属( Colletotrichum)和蜡壳菌属( Sebacina)真菌的相对多度值均达到20％;4株担子菌均分布于根中,叶组织中未有分布。根组织中内生真菌的多样性指数(H＝1.863)高于叶组织(1.098)。该研究结果及其所分离培养的担子菌类真菌,为更好地利用菌根技术进行白及等兰科植物资源的保护与可持续利用奠定了基础。     

一株酸枣内生菌的鉴定及其抗菌活性物质的初步分离

为了从酸枣中筛选出内生菌并分析其代谢产物中的活性成分,用于开发和生产药物,该研究通过组织块分离法和划线分离法,从陕北野生酸枣植株体内分离得到内生菌,采用平板对峙法测定其对7株供试指示菌的抗菌活性,以心神宁片提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明:从野生酸枣中共分离得到121株内生菌,其中内生细菌49株,内生放线菌6株,内生真菌66株;通过抗菌试验,发现54株内生菌(细菌33株,真菌21株)对1～7种指示菌具有抗菌活性,占分离菌株总菌数的44.63%,其中A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04共6株菌株的抗菌谱较广,对7种供试指示菌均具有抑菌活性;薄层层析检测结果显示菌株B-03发酵产物在R_f值为0.46处有与酸枣提取液层析带迁移率相同的显色带,液相色谱分析结果显示其属于黄酮类物质;通过16S rRNA基因序列分析结果显示菌株B-03与Bacillus axarquiensis的相似性为99%。菌株B-03能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物,表明酸枣内生菌具有合成黄酮类药物的潜力。     

辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析

辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici) X2-3是从小麦根际分离的一株对多种病原真菌和卵菌有抑菌活性的菌株,目前对该菌株产生的抗菌物质及其产生调控机制尚不明确。【目的】明确转录因子LC_Clp对该菌株抗菌物质产生的调节作用,为深入了解L. capsici X2-3的生防机制提供依据。【方法】从转座子EZ-Tn5随机插入突变体库中筛选获得X2-3的LC_clp基因突变体M356,通过恢复性克隆获得功能互补菌株,分析LC_clp基因在拮抗活性、胞外酶分泌以及调控基因表达方面的差异。【结果】与X2-3相比,M356对测试病原真菌、卵菌的抑菌活性和产生体外抗菌物质的能力完全丧失,蛋白酶和纤维素酶产生量明显减少,几乎不产几丁质酶;所检测的转录调节因子、次生代谢及胞外酶等相关基因的表达量均显著低于野生株X2-3,而互补菌株MCS28和X2-3水平相当。【结论】LC_Clp不仅与菌株的抗菌物质合成及抑菌活性有关,还影响胞外酶的产生,并调控多种基因的表达,具有广泛的调节作用。     

蛹虫草表型多态性对子实体产生及虫草菌素的影响

为选育高产子实体和虫草菌素的蛹虫草菌株,从野生蛹虫草中分离单孢子并进行分型,之后进行产子实体实验;同时对蛹虫草子实体进行了产孢结构的观察,并用高效液相色谱仪检测了子实体和培养基中的虫草菌素。结果表明,菌落背面颜色为橙铬色的菌株容易产生子实体;出发(原代)菌株所产子实体在形态上更接近野生蛹虫草,而角变株的子实体畸形;出发菌株产子实体能力要比该菌株未发生角变部分分离株和角变部分分离株都强。在虫草菌素的产量上也以出发菌株为高,表明表型多态性对蛹虫草产子实体和虫草菌素有很大的影响。这对于优势菌种的筛选和生产实践有借鉴意义。     

拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价

[目的]对实验室分离到的菌株ZH-356进行鉴定并评价其对植物病原真菌的生物防治效果,为研发针对植物真菌病害的生防菌剂提供理论指导。[方法]通过平板对峙法确定菌株ZH-356抗菌谱,并通过16S rRNA基因序列分析确定其种属,利用离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验和患腐烂病苹果树的防治试验评价其生防效果。[结果]菌株ZH-356鉴定为链霉菌属,与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)相似性最高,为99.71%。抗菌谱试验表明,菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用,这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌菌丝变粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂。此外,ZH-356产生的抑菌活性物质对温度和酸碱度具有高度稳定性,并且该活性物质只存在于其胞内,只有当ZH-356遇到植物病原真菌时才会被分泌出来以抑制它们的生长。在离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验中,ZH-356对苹果树腐烂病防效可达94%以上,而在患腐烂病苹果树的防治试验中,ZH-356菌制剂对苹果树腐烂病的防效高达100%。[结论]链霉菌ZH-356抑菌谱广,对多种植物病原真菌均具有良好的拮抗活性,可作为防治植物真菌病害的生防菌株,为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害奠定了基础。