不同生物型烟粉虱体内Wolbachia共生菌的检测及其系统树分析

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内一类共生细菌,它能够通过多种机制调控宿主的生殖方式。近年来的研究表明,Wolbachia与许多外来生物的成功入侵相关。本文利用长PCR的方法特异扩增了不同生物型烟粉虱（共24个种群）体内Wolbachia的wsp基因,结果发现B型和Q型烟粉虱入侵种群体内均未检测到Wolbachia,而在非B/Q型的浙江种群和肯尼亚种群体内检测到了Wolbachia。对该wsp基因进行测序并和已知序列进行同源性分析发现,浙江烟粉虱种群的Wolbachia属于B组Con/Rug亚种群,而肯尼亚种群属于B组Btab1亚种群。Wolbachia的存在与否可能与烟粉虱的成功入侵有一定的关系。图2表2参23     

基于16S rDNA序列的Wolbachia的检测及分型

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生细菌。采用16S rDNA特异片段的PCR-RFLP方法对烟粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）不同生物型及米蛾Corcyra cephalonica （Stainton）共生菌Wolbachia进行了检测与分型分析。基于wsp基因对烟粉虱共生菌B组Wolbachia以及米蛾共生菌Wolbachia进行了系统树分析,并对相应的Wolbachia16S rDNA特异片段进行了克隆、测序以及序列比对。结果表明:16S rDNA的特异片段经NheⅠ酶切后RFLP图谱可有效检测与鉴别Wolbachia。烟粉虱共生菌Wolbachia的16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切后可得到预期RFLP图谱,而米蛾共生菌B组Wolbachia （基于wsp序列分析为B组）则产生不同的RFLP图谱。序列分析表明,Nauru型烟粉虱体内B组Wolbachia的16S rDNA片段序列与已知B组Wolbachia对应序列（DQ278884）同源性为100%;米蛾体内B组Wolbachia 16S rDNA特异片段有碱基变异,并存在于VspⅠ识别位点内,这是导致VspⅠ酶切后RFLP图谱不同的原因。结果提示,B组Wolbachia 16S rDNA特异片段经VspⅠ酶切的RFLP图谱存在多态性。本研究结果可为今后Wolbachia的检测与分型提供借鉴。     

我国烟粉虱自然种群中存在广泛的Wolbachia感染现象

Wolbachia是广泛分布于节肢动物生殖组织中的细胞质遗传的一类共生菌,可以引起宿主生殖行为的改变.烟粉虱是重要的农业害虫,已有的研究表明烟粉虱中存在Wolbachia的感染,但所检测到的感染率不高,并且迄今在烟粉虱中所检出的Wolbachia均属于B组群.该研究从我国河北、新疆、北京、山东、浙江、广西、海南、广州和福建采集到18个烟粉虱地理种群,首先基于ITS1 rDNA克隆测序鉴定了烟粉虱的生物型,然后采用自行设计的Wolbachia 16S rDNA及wsp基因的专用引物对所采集到的烟粉虱种群进行了分子检测.结果表明几乎所有的烟粉虱自然种群中都存在Wolbachia感染,同时还发现B/Q生物型烟粉虱中主要感染A组群Wolbachia,而非B/Q生物型烟粉虱中存在大量的超感染现象.该研究显示烟粉虱自然种群中Wolbachia的感染率比预想的要高得多,而分子检测方法的灵敏度可能是影响Wolbachia感染率研究的关键因素之一.     

浙江B型与非B型（China-ZHJ-1）烟粉虱种群共生细菌的检测及系统发育分析

烟粉虱体内存在共生细菌,包括初生共生细菌（primary endosymbiont）和次生共生细菌（secondary endosymbiont）。本项研究应用PCR技术检测了烟粉虱浙江B型和非B型China-ZHJ-1种群中共生细菌的分布。结果表明,烟粉虱B型和非B型体内均存在初生共生细菌,而两者次生共生细菌的组成存在差异。一种肠杆菌科次生共生细菌仅在B型烟粉虱中发现,而另两种次生共生细菌Wolbachia和杀雄菌Arsenophonus仅在非B型中发现。初生共生细菌的系统发育分析表明,B型是入侵生物型,而浙江非B型是本地生物型。     

中国部分地区柑桔木虱体内感染Wolbachia的检测及其系统发育分析

Wolbachia是一种广泛分布于节肢动物体内的共生细菌, 该共生菌经寄主卵的细胞质传播并参与多种寄主生殖活动调控, 对节肢动物的物种进化有着重要意义并可能应用于害虫的生物防治。本研究以柑桔黄龙病（Huanglongbing, HLB）的主要传播媒介——柑桔木虱Diaphorina citri为研究对象, 通过Wolbachia的16S rDNA、 细胞分裂基因（ftsZ）、 表面蛋白基因（wsp）的特异引物对来自于中国广西北海、 广西柳州、 广东深圳、 广东阳春、 福建福州5个地区的柑桔木虱进行PCR扩增, 并对扩增产物进行克隆测序, 与GenBank中相关序列进行比对分析, 建立了柑桔木虱共生Wolbachia的系统发育树。结果显示上述5个地区的柑桔木虱均存在Wolbachia感染, 通过Wolbachia的16S rDNA, ftsZ基因和wsp基因DNA序列的系统发育分析表明, 5个地区的柑桔木虱体内的Wolbachia均属于B组; 基于wsp基因的系统发育分析进一步表明5个地区的亚洲柑桔木虱体内的Wolbachia属于B组的Con亚组, 且不同地区柑桔木虱体内的Wolbachia的16S rDNA, ftsZ基因和wsp基因序列差异不明显。研究结果为认识柑桔黄龙病传播媒介昆虫的进化及其综合防治提供了重要的参考依据。     

烟粉虱复合种内共生菌多样性及其生物学意义

烟粉虱复合种Bemisia tabaci（Gennadius） complex内共生菌的种类可分为5类：变形菌门（Proteobacteria）γ变形菌纲的初级内共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum和次级内共生菌,变形菌门α变形菌纲Wolbachia属细菌,衣原体门（Chlamydiae）衣原体纲细菌CandidatusFritschea bemisiae以及拟杆菌门（Bacteroidetes）类噬胞细菌（Cytophaga-like-organism, CLO）。系统发育分析表明,烟粉虱初级内共生菌分为2支,一些初级内共生菌和宿主系统发育并不严格一致; 次级内共生菌分为3支,一些次级内共生菌可能存在水平传播或多次侵入的现象。上述5类内共生菌在烟粉虱不同生物型/地理种群内的分布存在差异。B型烟粉虱可能具有独特的初级、次级内共生菌,并且不含有或很少含有Wolbachia属细菌、衣原体纲细菌Candidatus Fritschea bemisiae以及类噬胞细菌（CLO）。最后探讨了不同内共生菌对烟粉虱宿主的生物学意义及其研究方向。     

微卫星位点BEM06与BEM23鉴别烟粉虱B型与Q型的有效性

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) B型与Q型是烟粉虱复合种中入侵性较强、分布较广的2种生物型, 当前在许多地区混合发生。这2种生物型的快速鉴别对其种群动态调查及入侵生态学研究具有重要价值。为了验证微卫星位点BEM06与BEM23鉴别B型与Q型烟粉虱的有效性, 本研究分析了这2个微卫星位点的等位基因在国内外17个B型、4个Q型、3个非B/Q型烟粉虱种群的分布特点。结果表明: 这2个微卫星位点的联合使用可鉴别B型与Q型烟粉虱, 但是无法有效地将B型、Q型与一些非B/Q型烟粉虱某些个体区分开来。结果提示: 利用微卫星位点BEM06与BEM23鉴别B型与Q型烟粉虱具有一定的局限性, 尤其是田间烟粉虱存在其他生物型时需要慎重使用这种鉴别方法。     

朱砂叶螨体内感染的Wolbachia的wsp基因序列测定与分析

应用Wolbachia的wsp基因特异引物,通过PCR扩增法对我国朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus7个地理种群进行了检测。在采自黑龙江佳木斯、安徽安庆、江苏镇江和浙江慈溪的4个地理种群中扩增出了596bp左右的Wolbachia的wsp基因片段,而在河北威县、山东滨州和湖北赤壁3个地理种群中未发现这个Wolbachia特征基因片段,表明 Wolbachia在我国朱砂叶螨中的侵染较为普遍。通过对我国朱砂叶螨体内感染的 Wolbachia的wsp基因序列进行系统发育分析,得出它们全部与B大组的Ori组的Wolbachia株十分相近或完全相同,提示它们可能是相近或相同的株。     

华东、华南和西南地区烟粉虱的种群及寄主分化

烟粉虱Bemisia tabaci是一个复合种,它具有的生物型分化、较强的传播病毒的能力和抗药性、较快的繁殖速率等特征使其成为我国农业生产中重要害虫之一。本研究利用细胞色素线粒体氧化酶Ⅰ基因,对采集自江苏、广东和云南三省的烟粉虱样本进行了生物型鉴定,并对烟粉虱生物型与寄主植物之间的关联性开展了调查。结果表明,在广东和云南省,都存在未鉴定的土著种群与入侵的B型、Q型共存的现象;同时,在本研究中广东省尚未采集到Q型烟粉虱,而在江苏采集到的粉虱样本全部为入侵型。研究结果还表明,相对于入侵种而言,土著种群显示出更强的寄主植物趋同性;丰富的寄主植物以及本身具有的多食性特性有助于B型、Q型等生物型在世界各地的广泛入侵。     

北京地区亚洲玉米螟种群中Wolbachia超感染

Wolbachia是一类广泛分布于节肢动物体内,可以引起节肢动物生殖行为改变的细胞内共生细菌。亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)是我国常见的鳞翅目害虫,尤其对玉米危害严重。本文通过对Wolbahcia的wsp基因的PCR扩增及克隆测序,明确了Wolbachia在北京地区亚洲玉米螟野生种群中的分布情况。结果表明,在检测的种群中,存在两种类型的Wolbahcia,分别将其命名为wFurA（GenBank注册号为EU294311）和wFurB（GenBan k注册号为EU294312）;系统树分析表明其分别属于Wolbahcia A组和B组。本研究首次明确了在我国亚洲玉米螟的野生种群内存在着Wolbachia的超感染现象。     

Analysis of genetic diversity among different geographical populations and determination of biotypes of Bemisia tabaci in China

Abstract:  Analysis of the genetic diversity among 27 different geographical populations of Bemisia tabaci and determination of biotypes of B. tabaci in China based on amplified fragment-length polymorphism (AFLP) and the mitochondrial cytochrome oxidase I (mtDNA COI) gene sequences were conducted. In AFLP assay, the use of five primer combinations selected from 64 primer combinations allowed the identification of 229 polymorphic bands (97.03%) from 60 to 500 bp, suggesting abundant genetic diversity among different geographical populations of B. tabaci. To further identify biotypes of B. tabaci in China, the mtDNA COI gene sequences of nine representative populations from China, Israel and Spain were obtained. Molecular phylogenetic tree based on AFLP and mtDNA COI gene analyses revealed the presence, in China, of at least four different genetic groups of B. tabaci. B biotype, Q biotype and two non-B/Q biotype. B biotype was distributed nationwide. Q biotype was present only in the local region of China including the YunNan province and BeiJing city. This was also the first report about the invasion of Q biotype into China. Of the other two non-B/Q biotype groups, one was found in ShanDong and HeBei provinces, and another in ZheJiang province. The non-B/Q biotype ZheJiang population showed very high similarity with another Asian population India-IW ( AF110704 ) in mtDNA COI sequences and was possibly a Chinese indigenous population. The close monitoring of the Q biotype in locales of China where commercial plants were exported or imported, is now essential to avoid the further accidental distribution of the Q biotype.     

Biotype-dependent secondary symbiont communities in sympatric populations of Bemisia tabaci

The sweet potato whitefly, Bemisia tabaci, harbors Portiera aleyrodidarum, an obligatory symbiotic bacterium, as well as several secondary symbionts including Rickettsia, Hamiltonella, Wolbachia, Arsenophonus, Cardinium and Fritschea, the function of which is unknown. Bemisia tabaci is a species complex composed of numerous biotypes, which may differ from each other both genetically and biologically. Only the B and Q biotypes have been reported from Israel. Secondary symbiont infection frequencies of Israeli laboratory and field populations of B. tabaci from various host plants were determined by PCR, in order to test for correlation between bacterial composition to biotype and host plant. Hamiltonella was detected only in populations of the B biotype, while Wolbachia and Arsenophonus were found only in the Q biotype (33% and 87% infection, respectively). Rickettsia was abundant in both biotypes. Cardinium and Fritschea were not found in any of the populations. No differences in secondary symbionts were found among host plants within the B biotype; but within the Q biotype, all whiteflies collected from sage harboured both Rickettsia and Arsenophonus, an infection frequency which was significantly higher than those found in association with all other host plants. The association found between whitefly biotypes and secondary symbionts suggests a possible contribution of these bacteria to host characteristics such as insecticide resistance, host range, virus transmission and speciation.     

B型烟粉虱与浙江非B型烟粉虱的竞争

为了了解近年来入侵中国的B型烟粉虱(Bemisiatabaci)取代本地非B型烟粉虱的潜能,在室内将一个B型与一个浙江非B型烟粉虱种群混合饲养在不同寄主植物上,跟踪观察混合种群中两个生物型个体数量相对比例的变化。结果表明,当两种生物型在棉花(Gossypiumhirsutum)上以相同初始数量共存竞争时,经过6代,非B型完全被B型替代;而在西葫芦(Cucurbitapepo)上以相同初始数量共存竞争时,只经过2代,非B型即完全被B型替代。在棉花上,即使以非B型占87%、B型占13%开始共存竞争,经过225d后,非B型也完全被B型替代。这说明B型烟粉虱具有在短期内竞争取代浙江非B型烟粉虱的能力。经分析,B型除了寄主范围比非B型的宽这一点对其竞争有利外,较强的内在竞争潜能也是其能成功入侵并替代本地非B型烟粉虱的一个重要原因。     

烟粉虱B型和Q型群体遗传结构的RAPD分析

近20年来,烟粉虱B型传入世界各地并暴发成灾,成为一种重要的农业入侵害虫; 烟粉虱Q型则是近几年引起人们高度重视的一种新的入侵生物型,目前已传入许多国家并造成一定危害。本文利用RAPD分子标记对烟粉虱B型和Q型不同地理种群的遗传结构进行了分析。结果表明：（1）引物H16对烟粉虱B型不同种群扩增的特异带,能有效区分烟粉虱B型和Q型、浙江非B/Q型种群;（2）烟粉虱Q型种群各项遗传多样性指数均比烟粉虱B型的要高;（3）我国烟粉虱Q型来自伊比利亚半岛的可能性比来自中东地区的可能性要大。另外,聚类分析结果提示,RAPD分子标记能有效地区分烟粉虱不同生物型,但可能不适用于生物型之间亲缘关系分析。     

B型与浙江非B型烟粉虱药剂敏感性的比较

比较了新入侵我国的B型烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)与非B型烟粉虱ZHJ-1种群对5%吡虫啉乳油和5%吡丙醚乳油2种杀虫剂的敏感性。ZHJ-1种群卵、若虫和成虫对这2种药剂的敏感性均比B型的明显或显著要高。吡丙醚具有高杀卵活性,在有效成分为0.25mg/L时,2个烟粉虱种群卵的死亡率高于90%。药剂敏感性的差异可能是B型竞争取代本地非B型烟粉虱的一个重要原因。     

三种抗生素对B型和Q型烟粉虱内共生菌的去除效果比较研究

利用烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)内共生菌特异性引物,研究了内共生菌在B、Q型烟粉虱种群中的分布和感染率,同时评价了3种不同的抗生素利福平、氨苄青霉素和硫酸卡那霉素分别在3种不同的浓度下(100.0、50.0及25.0μg/mL)对烟粉虱内共生菌的去除效果。结果表明:B、Q型烟粉虱原生内共生细菌Portiera的带菌率均为100.0%;B、Q型烟粉虱次生内共生菌Hamiltonella的带菌率分别为91.7%和100.0%;B型烟粉虱次生内共生菌Rickettsia的带菌率为87.5%,Q型为0;其它次生内共生菌在B、Q型烟粉虱中均未检测到。利福平、氨苄青霉素和硫酸卡那霉素在3种不同的浓度下均不能去除B、Q型烟粉虱Portiera;利福平、氨苄青霉素在3种不同的浓度下均能完全去除B型烟粉虱Rickettsia,硫酸卡那霉素在不同浓度下去除Rickettsia的效果不同;3种抗生素去除Hamiltonella的能力受抗生素种类以及浓度的影响。同一抗生素在不同浓度下去除Hamiltonella的效果均是100.0μg/mL>50.0μg/mL>25.0μg/mL;不同浓度的抗生素去除Hamiltonella的效果均是利福平>氨苄青霉素>硫酸卡那霉素,各浓度与各抗生素之间的去除Hamiltonella的效果均具有显著性差异。