基于CRISPR编辑系统的DNA片段删除技术

基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术已成为基因功能研究和遗传修饰的重要工具。在引导RNA的引导下, Cas9蛋白对基因组靶位点进行精准切割产生DNA双链断裂(DSB), 借助细胞内的DSB修复机制, 可实现基因组靶位点碱基的缺失、插入或者替换, 甚至发生片段删除。该文介绍了基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统的DSB微同源末端连接修复方式(MMEJ)提高基因组DNA片段删除效率的方法, 主要从靶点设计和突变检测方面展开详细描述。     

细菌中CRISPR/Cas系统的应用和优化

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术,CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低等优势。其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR/Cas系统分别仅需要单个Cas9蛋白和单个Cpf1蛋白作为切割双链DNA的工具,因此特别受到研究者们的青睐。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于斑马鱼、小鼠、人类细胞等真核生物的基因组编辑中,并取得一系列重要成果,但在细菌领域进行的相关研究并不多。文中将简单描述CRISPR/Cas系统及其作用机制,重点介绍该系统的优化以及近年来其在细菌学领域所取得的进展。     

家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类 (Ⅴ型) 能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1) 表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点。该文对CRISPR/Cas9系统的结构组成和功能机制,动植物基因靶向编辑和人类在遗传性疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤方面进行综述,旨在对CRISPR/Cas9系统的现状和发展进行总结和展望。     

基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略研究进展

CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶之后的第三代基因组定点编辑工具,因其具有特异性切割双链DNA的能力,被广泛应用于基因编辑、生物传感等领域。Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)等蛋白"附属切割"活性的发现,拓展了CRISPR/Cas系统在生物传感中的应用。近年来,研究人员开发出一系列快速、超敏、高特异性的生物传感系统用于分子检测,如SHERLOCK,DETECTR等。本文主要综述了基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略的研究进展,并展望了其未来发展的方向。     

植物CRISPR基因组编辑技术的新进展

在过去的4年中,CRISPR/Cas9基因组编辑技术成为生命科学领域的革命性工具,为植物学基础研究和农作物遗传改良提供了高效、快速而又廉价的遗传操作工具。利用CRISPR/Cas9系统可以实现精准的knock-out和knock-in等遗传操作,也可用于靶向激活或抑制基因的表达。在CRISPR/Cas9被广泛地用于基因组编辑的同时,它的编辑能力、效率和精确度也在不断地改进和完善,特别是CRISPR/Cpf1系统的发掘和单碱基编辑技术的创建,使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传工程技术平台。此外,利用CRISPR/Cas9技术改良的农作物品种也已经涌现,这必将推动精准基因组编辑技术在农作物遗传改良中的应用和发展。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

CRISPR/Cas9系统在培育抗病毒植物新种质中的应用

随着CRISPR/Cas9系统在基因组编辑技术上的开发和完善,CRISPR/Cas9系统在应用于动物病毒感染性疾病防治并取得相当成效的同时,也逐步被应用到对植物病毒基因组进行高效靶向修饰的研究中。CRISPR/Cas9系统对基因组靶向修饰作用不仅实现了对植物DNA病毒基因组序列的编辑,还展示了其有效作用于植物RNA病毒基因组的潜力,同时CRISPR/Cas9系统还能在基因转录和转录后调控水平发挥作用,说明该系统具有通过多种途径调控植物病毒复制的潜能。相对其他植物病毒病防治策略,该系统对病毒基因组的编辑更精准、对基因表达的调控更稳定,对病毒病的抗性也更为广谱。本文将CRISPR/Cas9系统与其他植物病毒病防治策略进行了比较,概述了该系统在培育植物抗病毒病新种质中的优势,分析了其具体应用在该领域中面临的主要问题,讨论了该系统在培育抗病毒植物新种质应用中的发展趋势。     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

毕赤酵母胞嘧啶碱基编辑器的设计与功能评价

【目的】在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中建立一套分子靶向突变系统，为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具。【方法】基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术，设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor，CBE），并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能。电转化酵母后，利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式，并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列（即spacer）长度等因素对CBE功能的影响。【结果】nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑。当连接肽长度为（GGGGS）₁₀时，CBE的编辑效率最高，编辑窗口位于前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）远端的C20–C14之间，其中C18的编辑效率可达85.1%。nCas9与PmCDA1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大。而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率，且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt，但19–23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑。【结论】本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器，为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持。     

空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的研究进展

多数细菌都存在发挥免疫防御机制作用的CRISPR/Cas系统,在不同种属间呈现多态性。空肠弯曲菌是全球范围内重要的食源性病原菌,所致疾病也是典型的自限性疾病,其复杂的致病机制并未得到明确的解析,而空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的结构呈现多态性,研究两者关系仍存在诸多限制。本文从CRISPR/Cas系统在空肠弯曲菌中的结构、机制及技术应用等方面的研究进展进行综述,为探索空肠弯曲菌致病机制提供新思路。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在癌症研究中的应用

CRISPR/cas9基因组编辑技术因其设计简单以及操作容易,使其在基因编辑的研究中越来越受到欢迎。利用该技术,科研人员可以实现在碱基的水平对基因组进行定点修饰。CRISPR系统现已经被广泛地应用到多个物种的基因组编辑以及癌症的相关研究中。本文在最新研究进展的基础上,结合对癌症研究及基因组编辑技术的理解,对CRISPR/Cas9技术在癌症研究中的应用进行了综述。     

谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势。目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱基编辑工具,并实现了两基因和三基因的同时编辑。文中针对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统中存在的不足(多重sgRNA结构烦琐、重复序列干扰、更换靶点困难等),采用多种策略进行优化,并比较碱基编辑效率:首先优化基于单独启动子/终止子的多重sgRNA表达框,通过构建框架质粒,并结合Golden Gate连接方法,加速靶点更换,避免重复序列干扰,虽然该方法 sgRNA结构烦琐,但编辑效率最高;同时,开发基于Type ⅡCRISPR crRNA阵列、tRNA加工的多重gRNA表达框,这两种形式均只需要一个启动子和一个终止子序列,极大地简化了表达框结构,虽然编辑效率均出现下降,但仍具有一定的实用性。该研究丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具,为该菌株的遗传改...     

磷脂酰肌醇3激酶通过Akt和ERK抑制盘基网柄菌细胞的趋电性

目的 磷脂酰肌醇3激酶（PI3Ks）通过调控肌动蛋白在细胞定向运动中发挥重要作用。然而,PI3Ks的结构和功能很复杂,人们对PI3Ks在细胞趋电性运动中的作用并不完全清楚。因此,本文以模式生物盘基网柄菌细胞为实验材料,探究其中的PI3K1和PI3K2在细胞趋电性运动中的作用。方法 首先利用CRISPR/Cas9系统介导分别构建PI3K1编码基因pikA基因敲除突变株和PI3K2编码基因pikB基因敲除突变株;随后将2个突变株置于强度为12 V/cm的直流电场中,记录并分析两个突变株的趋电性。结果 数据分析显示,野生型细胞在直流电场中的方向指数为（0.86±0.03）,而pikA-和pikB-突变株在直流电场中的运动方向指数分别为（0.95±0.02）和（0.94±0.03）;此外,野生型细胞在电场中的平均轨迹速度（3.34±0.08）μm/min,而pikA-和pikB-突变株的平均轨迹速度分别为（4.85±0.20）μm/min和（5.48±0.15）μm/min,t检验表明突变株和野生型的方向性指数和运动速度都存在极显著的差异。蛋白质印迹实验结果显示,pikA-和pikB-突变株中...     

生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白北大核心CSCD

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)是一种重要的人兽共患病原菌,在对该菌感染的预防与控制上一直存在困难,而糖蛋白疫苗的出现为其预防提供了新的思路。对于糖蛋白的合成,一般采用传统的化学交联方法,该法制备流程烦琐、生产成本高。因此,探索经济且稳定的生物合成方法非常必要。为了实现生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白,本研究利用CRISPR/Cas9方法构建肠炎沙门菌waa L基因缺失株SEΔwaa L,使用银染的方法检测细菌外膜脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的合成情况。使用环形PCR方法构建了表达寡糖转移酶PglL、重组铜绿假单胞菌的外毒素(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)和霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)的表达质粒,并分别在rEPA的N端和CTB的C端加入了PilE;糖基化位点序列。将重组质粒转化到SE ΔwaaL中,诱导表达后通过Western blotting方法对糖蛋白的合成进行验证,并通过镍柱(Ni-NTA)对糖蛋白进行纯化。结果表明,waaL基因的缺失阻断了肠炎沙门菌LPS正常合成,在该缺失株中rEPA和CTB蛋白均可成功表达。此外,在表达寡糖转移酶PglL的情况下,rEPA和CTB发生了明显的糖基化,其糖基化部分为肠炎沙门菌O抗原多糖。本研究结果证明肠炎沙门菌缺失waaL基因后,在寡糖转移酶PglL的作用下可以将自身O抗原多糖链共价连接到载体蛋白rEPA和CTB上,形成糖蛋白,为生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白的研究奠定了基础。     

CRISPR/dCas9干扰bcsD基因表达调控细菌纤维素结构

木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)是细菌纤维素的主要生产菌株。在该菌中,BcsD是纤维素合酶的亚基之一,参与细菌纤维素的组装过程。利用CRISPR/dCas9系统调控bcsD基因的表达量,获得了一系列bcsD基因表达量不同的木葡糖酸醋杆菌。通过分析细菌纤维素的结构特征发现,细菌纤维素的结晶度和孔隙率随着木葡糖酸醋杆菌中bcsD表达量的变化而发生改变。其中孔隙率的变化范围在59.95%–84.05%之间,结晶度的变化范围在74.26%–93.75%之间,而细菌纤维素的产量并未因bcsD的表达量变化而发生显著下降。结果表明,bcsD的表达量低于55.34%后,细菌纤维素的孔隙率显著上升,并且细菌纤维素的结晶度与bcsD的表达量呈正相关。最终,通过干扰bcsD基因的表达,实现了一步发酵木葡糖酸醋杆菌获得了产量稳定且结构不同的细菌纤维素。     

嗜热厌氧杆菌热稳定CRISPR/Cas9基因组编辑技术及在细胞工厂构建中的应用研究进展

嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)来源的菌株作为一个高温发酵的细胞工厂,具有生产生物燃料和化学品的潜力,已引起了研究者的广泛兴趣.随着嗜热厌氧杆菌属来源的多个菌株全基因组测序的完成以及相关的生理生化实验的开展,建立一个简便、快捷的基因操作技术将有助于进一步深入理解和认识嗜热厌氧杆菌有关的代谢途径.最...     

Locus-specific integration of extrachromosomal transgenes in C. elegans with the CRISPR/Cas9 system

We established a method to generate integration from extrachromosomal arrays with the CRISPR/Cas9 system. Multi-copy transgenes were integrated into the defined loci of chromosomes by this method, while a multi-copy transgene is integrated into random loci by previous methods, such as UV- and gamma-irradiation. The effects of a combination of sgRNAs, which define the cleavage sites in extrachromosomes and chromosomes, and the copy number of potential cleavable sequences were examined. The relative copy number of cleavable sequences in extrachromosomes affects the frequency of fertile F1 transgenic animals. The expression levels of the reporter gene were almost proportional to the copy numbers of the integrated sequences at the same integration site. The technique is applicable to the transgenic strains abundantly stored and shared among the C. elegans community, particularly when researchers use sgRNAs against common plasmid sequences such as β-lactamase.