短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,得到重组质粒pHBM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。     

嗜热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

木聚糖酶Umxyn10A,属于GH10家族,包含一段跨膜区和GH10家族催化功能域,将跨膜区去掉后,剩余部分重命名为Umxyn10AQ。按毕赤酵母密码子偏好性将Umxyn10AQ序列进行密码子优化,与毕赤酵母表达载体p PIC9K相连。重组质粒p PIC9K-Umxyn10AQ经SalⅠ单酶切线性化后转至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组毕赤酵母菌株GS115/Umxyn10AQ,每12 h添加1%甲醇诱导剂。DNS法测定重组木聚糖酶re Umxyn10AQ酶活,最高酶活达到15 U/m L,SDS-PAGE分析表明,re Umxyn10AQ相对分子质量为45.0 k D。重组木聚糖酶re Umxyn10AQ的最适p H为8.0,最适反应温度85℃,Co2+对该酶活有显著促进作用,提高了近20%,水解产物为木糖(14%)、木二糖(86%)。结果表明,木聚糖酶Umxyn10AQ在毕赤酵母中成功表达并且分泌到胞外,相较于大肠杆菌表达产物Umxyn10A,最适p H提高了1.5个单位、最适温度提高了10个单位,p H耐受性和温度耐受性都有所改善,并且主要水解产物仍为木二糖。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酶母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pH-BM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达,将重组毕赤酵母KM71（pHBM220）,GS115（pHBM220),GS115(pHBM220),SMD1168（pHBM220）分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃,在其最适反应条件下测得三粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL,重组毕赤酵母KM71（pHBM220）所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三没有太大的差异。     

木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析

木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,通过毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶Man A共表达重组质粒p PICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273. 6 U/ml和256. 8 U/ml,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/Man A酶活的30. 4%和73. 4%。酶学性质的分析显示DSB和Man A的最适反应温度均为75℃,在45℃～75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上; DSB最适pH为6. 5,Man A最适pH为6. 0,在pH 3. 0、40℃条件下,Man A处理1h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上; DSB和Man A对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。通过单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。     

桔青霉木聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达及活性分析

通过同源序列PCR克隆的方法,获得桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2菌株的木聚糖酶编码基因xyl,该基因全长984 bp,编码327个氨基酸,无内含子序列,具有完整开放阅读框。其编码的氨基酸序列N端具有一段包含19个氨基酸的信号肽序列,并具有糖基水解酶第10家族(GH10)的保守催化域特征,推测该酶属于第10家族成员。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9相连接构建重组载体pPIC9-XYL,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中。挑选阳性重组子经测序、酶活性以及SDS电泳分析表明,xyl基因成功在毕赤酵母中分泌表达,重组酶活性可达214.15 IU/mL。该重组酶最适温度与最适pH分别为50℃和4.5,且具有良好的pH和热稳定性。     

Optimization of fermentation conditions of xylanase produced by recombinant Pichia pastoris

采用单因素实验确定重组毕赤酵母产木聚糖酶生长相的最适条件,然后利用Plackett-Burman实验设计对诱导相培养基成分和培养条件的10个因素进行筛选,方差分析结果表明,影响木聚糖酶表达的主要因子为酵母膏、诱导pH和摇床转速;在此基础上,用Box-Behnken的响应面方法对3个因素进行进一步优化,当酵母膏为11.13 g/L,pH为6.38,摇床转速为228 r/min时酶活有最大值,为262.77 U/mL,较优化前提高了175.44％.优化后的摇瓶发酵条件应用于7L发酵罐并连续诱导培养120 h,发现诱导72 h后的木聚糖酶酶活最高,为2054.89U/mL.     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化研究

采用单因素实验确定重组毕赤酵母产木聚糖酶生长相的最适条件,然后利用Plackett—Bur—man实验设计对诱导相培养基成分和培养条件的10个因素进行筛选,方差分析结果表明,影响木聚糖酶表达的主要因子为酵母膏、诱导pH和摇床转速;在此基础上,用Box—Behnken的响应面方法对3个因素进行进一步优化,当酵母膏为11．13彰L,pH为6．38,摇床转速为228r／min时酶活有最大值,为262．77u／mL,较优化前提高了175．44％。优化后的摇瓶发酵条件应用于7L发酵罐并连续诱导培养120h,发现诱导72h后的木聚糖酶酶活最高,为2054．89u／mL。     

来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表达及性质的比较分析

高效表达高比活木聚糖酶是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成本的有效途径。将橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis) A1的高比活木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组酵母,在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,且表达产物具有生物学活性。在3L发酵罐中蛋白表达量约14mg/mL, 酶活性(效价)为1200IU/mL。SDSPAGE分析表明,表达的木聚糖酶XYNBa为糖基化蛋白, 分子量为31kD, 经脱糖基化处理得到21kD 的XYNBb, 与橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB大小一致。通过对XYNB、XYNBa及XYNBb酶学性质的比较发现：三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明：酶解产物的主要成分为木二糖、木三糖和木四糖,占总糖含量的95%以上。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建米曲霉木聚糖酶基因的真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母,进行分泌表达。方法:以米曲霉总RNA为模板,根据已知的米曲霉木聚糖酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆木聚糖酶基因cDNA序列,将其与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,经MM/MD快慢斑筛选,得到Muts型重组子,进行甲醇诱导表达。结果:克隆得到的cDNA序列全长666 bp,连续编码221个氨基酸;阳性克隆子在诱导培养数天后,将菌液点于RBB-木聚糖平板上,产生了明显的透明圈,表明重组木聚糖酶在毕赤酵母中获得表达。结论:木聚糖酶基因的真核表达载体构建成功,并能够在毕赤酵母中表达。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

角毛壳菌几丁质酶基因chi58多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

应用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,gene SOEing),简称SOE-PCR对角毛壳菌(Chaetomium cupreum)的几丁质酶基因chi58进行多点突变.依据毕赤酵母密码子偏爱性,将毕赤酵母中编码Arg使用频率几乎为0的密码子CGC突变为使用频率高的AGA,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9K-chi58A,电转化毕赤酵母GS115,获得的重组酵母株在诱导120 h酶活力最高,平均可达101.71 U/mL±3.33 U/mL;其活力比未优化重组酵母株(31.83 U/mL±4.85 U/mL)提高了约3倍,且经10代传代培养后遗传稳定性良好.表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为58 kD.     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

Expression of Humicola insolens (NC3) endo-β-glucanase Ⅱgene in Pichia pastoris and anylysis of enzymic properties

[目的]在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究.[方法]利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ的cDNA.将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115.[结果]SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达.重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70℃,且在65℃以下具有较好的热稳定性.最适反应pH为6.5,在pH 6.0-7.0之间有较好的稳定性.[结论]用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础.     

运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤氏酵母中的表达

运用PCR介导的定点突变对米曲霉(Aspergillus　oryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究,获得一表达量远远高于亲本的突变株I156A,对其进行了提纯并研究其酶学特性,除热稳定性外其余与亲本基本一致。突变株I156A所产木聚糖酶XynFl的分子量为35kD,在pH 4～9范围内稳定,最适pH为70,最适温度为45℃,在50℃以下稳定性略高于亲本。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达

根据绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422菌株内切葡聚糖酶基因egⅡ的cDNA序列,设计特异引物,以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1 194bp的egⅡ成熟肽cDNA片段.将该片段分别克隆到大肠杆菌(Escherichia coil)表达载体pET-28a( )和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌Rosset(DE3)和毕赤酵母GS115中进行了表达.重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性.重组毕赤酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2 788U/ml.酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,pH 3.5～6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上.