乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响

【目的】慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染在肝硬化和肝癌的发生过程中起着重要的作用,通过研究HBV感染对细胞基本自噬的影响,为HBV感染诱发肝癌以及HBV的免疫逃逸机理研究提供新的思路。【方法】本研究利用乙肝病毒表达质粒瞬时或稳定转染不同肝细胞,通过计数绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)聚集数目检测自噬小体形成,western blot检测LC3(microtubule-associated proteinlight chain 3,微管相关蛋白质轻链3)脂酰化和p62的降解,通过构建HBV B型和C型X蛋白(HBx)的表达质粒并瞬时转染肝癌细胞和正常肝细胞,对不同基因型X蛋白对细胞自噬的影响进行了分析。【结果】乙肝病毒感染后促进了LC3的脂酰化和p62的降解,增加了自噬小体的形成,增强了细胞的基本自噬。进一步研究发现,HBV感染增强的细胞基本自噬水平由HBx所引发,且C型HBx比B型对细胞基本自噬的增加更加显著。【结论】HBV通过HBx增强细胞的基本自噬,且不同基因型HBx对细胞基本自噬的增强程度不同,为进一步阐明HBV感染机理奠定了基础。     

乙肝病毒感染导致Mrell下调及基因组断裂

[目的]乙肝病毒的持续感染与肝细胞癌的发生密切相关.本文探讨了乙肝病毒感染后导致宿主蛋白Mrell的变化,并研究这种蛋白的变化可能导致肝癌发生的机制.[方法]本文通过Westernblot检测了乙肝病毒感染HL7702细胞及肝癌组织标本的Mrell蛋白的变化,并且通过RNA干涉的方法干扰了Mrell的表达,用连接介导PCR检测基因组的变化.[结果]本研究发现乙肝病毒感染细胞导致Mrell表达下调,肝癌组织也可以发现Mrell表达下调;下调Mrell表达可以导致细胞基因组的断裂增多.[结论]HBV感染导致Mrell表达下调导致基因组不稳定,这可能与HBV感染导致细胞恶性转化相关.     

HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对神经胶质瘤U87细胞自噬的影响。通过观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因Beclin1及其蛋白表达的变化,从而探讨HCMV与神经胶质瘤发生、发展的关系及意义。用HCMV AD169(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,同时将未感染HCMV的U87细胞作为对照组。分别在6、12、24、48 h用RT-PCR检测Beclin1的表达,Western-blot和免疫荧光检测Beclin1和LC3编码蛋白的表达,最后用CCK-8检测细胞的增殖活性。结果显示,HCMV感染的U87细胞LC3-II蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05);同时,HCMV感染的U87细胞Beclin1基因及蛋白的表达水平也逐渐下降(P<0.01),且HCMV感染U87细胞增殖显著(P<0.01)。以上结果表明,HCMV感染抑制胶质瘤U87细胞自噬,并会引起Beclin1表达水平下调,进而导致胶质瘤细胞增殖。     

PC12细胞在缺氧条件下的自噬现象

目的：考察PC12细胞内自噬发生与缺氧时间的关系,探讨自噬对缺氧细胞的影响作用。方法：以PC12细胞为模型,将对数生长期的细胞加入96孔培养板,37℃、5% CO₂培养24 h后,放入0.5% O₂、94.5% N₂和5% CO₂的培养箱缺氧1 h、3 h、6 h、9h、12 h、24 h、36 h和48 h,用MTT法检测细胞存活率,透射电镜观察细胞内自噬体,Westen blot法检测自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）的表达,用试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性、活性氧自由基（ROS）和线粒体膜电位（MNP）水平,探究缺氧不同时间自噬对PC12细胞的作用。结果：在缺氧3~12 h,PC12细胞自噬明显增加,自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）表达增加,尤其是缺氧9 h,PC12细胞存活明显增加,表明短时间缺氧自噬对细胞起保护作用,而随着缺氧时间的延长细胞存活明显降低,自噬相关蛋白表达水平减少,细胞LHD和ROS水平明显增加。MMP水平显著下降,细胞凋亡明显增加。结论：在缺氧早期自噬对PC12细胞起保护作用,但缺氧时间较长,超过了细胞自身调节能力导致细胞死亡。     

细胞自噬形成机制及其功能研究进展

自噬是真核细胞维持内环境稳态的一种内在平衡机制。现已发现,多种自噬相关蛋白质(autophagy related protein or Atg protein)参与自噬形成。其中,自噬相关蛋白1/Unc-51样激酶1(autophagy related 1/Unc-51-like kinase 1,Atg1/ULK1)蛋白酶复合物主要在自噬形成起始阶段发挥作用;自噬相关蛋白9·自噬相关蛋白2-自噬相关蛋白18(autophagy related 9·autophagy related 2-autophagy18,Atg9·Atg2-Atg18)复合物主要为自噬形成递送膜结构;自噬相关蛋白12(autophagy related 12,Atg12)和自噬相关蛋白5/微管相关蛋白1轻链3(autophagy-related 5/microtubule-associated protein 1light chain 3,Atg5/LC3)结合系统主要参与隔离膜的延伸和自噬体的成熟;而泡膜蛋白34-自噬相关蛋白6/Beclin1磷脂酰肌醇-3激酶复合物[vacuolar proteins sorting 34-autophagy related 6/Beclin 1phosphatidylinositol-3 kinase,Vps34-Atg6/Beclin1 PI(3)P]则可与不同物质结合,在自噬的起始和自噬体成熟过程中发挥重要作用。随着研究的深入,细胞自噬被认为可特异性识别底物进行降解,如线粒体自噬、噬脂、异体吞噬等。因此,自噬与多种疾病的发生发展密切相关,如神经系统疾病、肿瘤、心血管疾病、感染、代谢性疾病、特发性肺纤维化、肺动脉高压等疾病并参与衰老等生理过程。目前,一批以自噬为靶点的自噬调节剂正在临床试验阶段。     

过表达Beclin 1对食管癌Eca109细胞株裸鼠成瘤的影响

自噬是一个进化上保守的溶酶体降解途径,激活自噬可以降解有缺陷的细胞器而发挥抑制肿瘤的作用,Beclin 1是关键的自噬和肿瘤抑制基因。该研究检测了Beclin 1蛋白在食管癌组织中的表达情况,构建Beclin 1的重组质粒并转染人食管癌Eca109细胞株。分别以电子显微镜观察自噬体的形成和Eca109细胞的自噬性死亡情况,RT-PCR检测Beclin 1基因的mRNA表达,Westernblot法检测Beclin 1及Bcl-2、P53的表达水平,裸鼠成瘤实验检测Beclin 1基因对Eca109细胞体内增殖的影响。结果显示,Beclin 1蛋白在食管癌组织中相对于癌旁正常食管组织低表达(P<0.05);成功构建了Beclin 1重组质粒并将其转染到Eca109细胞中,电子显微镜观察到自噬体形成,RT-PCR和Western blot显示Beclin 1基因过表达。升高Beclin 1蛋白的表达水平能降低Bcl-2表达和上调P53蛋白,使Eca109细胞的体内致瘤性减弱。过表达Beclin 1基因对食管癌有很好的抑制作用,这将为食管癌的靶向治疗奠定基础。     

HIF-1α/BNIP3信号通路对BCG诱导巨噬细胞自噬的影响

【背景】缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)是响应细胞低氧反应的关键因子,在红细胞生成、血管形成、能量代谢及调节宿主免疫代谢中发挥着重要作用。【目的】探讨HIF-1α/Bcl-2-腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2-adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3,BNIP3)信号通路对牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响。【方法】构建HIF-1α的小干扰RNA (siHIF-1α),转染RAW 264.7细胞后,结合BCG感染,采用流式细胞仪检测细胞自噬率,用Western blotting或免疫荧光技术检测HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin 1、Rheb和mTOR的表达水平。【结果】BCG感染显著上调巨噬细胞中LC3和HIF-1α的表达,用siHIF-1α结合BCG感染后显著下调巨噬细胞中HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin 1和细胞自噬率水平,并促进Rheb和p-mTOR的表达。【结论】在BCG感染RAW 264.7细胞过程中,干扰HIF-1α表达抑制了HIF-1α/BNIP3信号通路,进而激活了mTOR途径,抑制BCG感染诱导的细胞自噬。     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。     

嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP)对RAW264.7细胞自噬的影响

【目的】观察嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(immunogenic protein,IP)对RAW264.7细胞自噬流及自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。【方法】采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP),并用CCK-8法检测IP对RAW264.7细胞半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC₅₀)。采用低浓度(0.05×IC₅₀)、中浓度(0.1×IC₅₀)、高浓度(0.2×IC₅₀) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养1、3、6、12 h,并设细胞对照组,应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化,筛选最佳浓度进行后续实验;最佳浓度IP与RAW264.7细胞进行体外共培养6、12、24 h,并设细胞对照组,RT-qPCR检测各组自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、SQSTM 1 (sequestosome 1,p62)及组蛋白去乙酰化酶6 (histone deacetylase 6,HDAC6)的mRNA表达水平;Western blotting法检测各组自噬相关因子的蛋白表达水平;免疫荧光检测各组自噬相关因子的表达。【结果】根据CCK-8结果计算IC₅₀为0.26μg/μL。自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测自噬流结果显示,与对照组相比,中浓度(0.026μg/μL) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养后自噬流抑制显著。RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,IP与RAW264.7细胞共培养6 h,P62表达水平升高,LC3B、HDAC6、Beclin1表达水平均降低,P<0.05;与6 h组相比,12 h组LC3B表达水平降低,P62、HDAC6及Beclin1表达水平均升高,P<0.05;与12 h组相比,24 h组Beclin1表达水平升高,P<0.05。IP一定程度上以时间依赖的方式降低了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并升高了P62蛋白的表达水平,P<0.05。免疫荧光结果基本与RT-qPCR及Western blotting检测结果一致。【结论】嗜肺军团菌IP抑制巨噬细胞自噬,可能与通过影响自噬小体-溶酶体融合途径,干扰自噬小体及自噬溶酶体的形成、成熟等过程有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后自噬水平的变化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化前后自噬水平的变化,进一步研究BMSCs神经分化机制。方法:原代培养大鼠BMSCs,三代后用L-DMEM(2%DMSO+200μmol/L BHA)诱导其向神经细胞分化,采用免疫细胞化学方法检测神经元特异标记物NSE表达,采用RT-PCR方法检测自噬相关基因LC3B、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg10的表达,用Western blot及流式细胞术检测了自噬标志蛋白LC3B的表达。结果:大鼠BMSCs传3代后,贴壁的BMSCs可达90%以上,类成纤维细胞样梭形生长,经诱导剂作用5 h后,细胞呈现神经细胞样改变,NSE阳性率为(83±5)%。RT-PCR结果表明BMSCs向神经细胞分化后LC3B,Beclin1,Atg5,Atg7,Atg10的表达升高,流式细胞术检测LC3B的平均荧光强度升高,Western blot结果表明神经分化后LC3B-Ⅱ表达增加。结论:大鼠BMSCs向神经细胞分化后自噬水平增加。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.