周期性静水压对人软骨细胞IL-1beta和MMP-3 代谢的影响

目的：以正常成人软骨细胞及OA软骨细胞为研究对象,探讨在静水压作用下正常软骨细胞IL-1beta和MMP-3 代谢的变化, 以及与OA软骨细胞之间的差异。同时观察在力学信号刺激下软骨细胞的IL-1beta和MMP-3 代谢有无相关性。方法：将体外培养的 正常成人膝关节软骨第3 代软骨细胞随机分为加压组和对照组。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。将加压 组细胞放入高压恒温静水压加压系统,冲入含有95％的空气和5％的CO2混合气体,以10MPa 进行加压2h,共加压5d。分别于 加压前、加压第3 天、加压第5 天后取加压组、对照组和OA 组细胞培养液检测IL-1beta、MMP-3 含量。同时采用MTT 法分析3 组 细胞的增殖情况。对三组细胞中IL-1beta与MMP-3 的水平做双变量相关分析,采用方差分析对三组标本间的IL-1beta、MMP-3 含量进 行比较。结果：各组细胞IL-1beta与MMP-3 两者间存在正相关关系。OA组细胞中IL-1beta与MMP-3含量高于加压组和对照组,加压 组高于对照组。加压组、OA组软骨细胞的生长曲线与对照组相比增殖高峰降低,平台时间缩短。结论：10MPa 间歇性静水压加压 可抑制软骨细胞增殖,增加IL-1beta与MMP-3 分泌。     

周期性静水压对人软骨细胞活性的时间依赖性影响

目的：目前软骨细胞体外研究多为动物模型,本研究以正常成人软骨细胞研究对象,探讨在适当强度、类型的周期性静水压下不同持续时间对软骨细胞活性的影响,探究人软骨细胞体外培养、构建组织工程软骨合适的时间参数。方法：将体外培养的正常成人膝关节软骨第3代软骨细胞随机分为4组：4h组、8h组、12h组、对照组。应用高压恒温静水压加压系统,充入含有95％的空气和5％的CO2混合气体,以2MPa压力大小对3个实验组进行周期性加压,分别每天加压4h、8h、12h,三组加压时间均为10d。10d后倒置相差显微镜下观察4组细胞形态,甲苯胺蓝及II型胶原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并对II型胶原免疫细胞化学染色行半定量分析。MTT法分析各组软骨细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：3个实验组细胞增殖均快于对照组（P〈0．05）,与对照组相比4h组、8h组均抑制凋亡,12h组促进凋亡。12h组第6代细胞开始细胞形态即逐渐发生改变。结论：软骨细胞的增殖和凋亡水平对静水压的作用时间具有依赖性。在2MPa静水压力下,8h组更适合细胞生长,细胞活性更强。为进一步构建组织工程软骨人类模型及组织工程软骨的临床应用提供了一定的实验基础。     

人软骨细胞压力实验模型的建立与评估

目的:人承重关节内受到的多种机械应力(剪切力、张力、静水压力等)在调节关节软骨细胞的生理功能方面起着重要作用。建立对人膝关节软骨细胞施加不同强度周期性静水压的压力模型,观察不同压力强度下软骨细胞的生长形态、增殖和凋亡情况。方法:采用酶消化法分离培养正常成人膝关节软骨细胞,将培养的第3代软骨细胞分为6组:对照组、0.5 MPa组、1.0 MPa组、3.0MPa组、5.0 MPa组、8.0 MPa组,应用高压恒温静水压加载系统分别给予各组不同强度压力作用5 d,每日1 h。甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法鉴定软骨细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态和生长状况,流式细胞术检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线。结果:与对照组相比,0.5 MPa、3.0 MPa组无明显差异(P0.05);1.0 MPa组能促进软骨细胞增殖,抑制凋亡(P0.05);5.0 MPa组出现细胞增殖能力下降,细胞活力降低,凋亡率增加(P0.05);8.0 MPa组则表现出明显的细胞增殖的抑制和细胞凋亡趋势(P0.05),以及细胞形态学的改变。结论:不同强度的周期性压力对人软骨细胞的新陈代谢产生了不同影响,尤其在软骨细胞的增殖和凋亡水平方面。利用本压力实验模型能体外模拟人负重关节软骨细胞的受压情况,初步确定了人软骨细胞压力实验中压力梯度的选择。为软骨细胞的压力损伤研究提供了实验数据,为进一步探寻压力作用与骨关节炎的关系提供了实验平台。     

白介素1受体拮抗剂及转化生长因子β1对兔膝关节骨性关节炎（OA）的治疗研究

目的：通过关节腔内注射白介素l受体拮抗剂（IL-1Ra）及转化生长因子β1（TGF]B1）,观察其对骨性关节炎的治疗作用。方法：16只3-4个月龄新西兰大白兔（雌雄不限）随机分为四组,每组四只,分为正常组,对照组,IL1-Ra组,TGF-β组,正常组仅打开左膝关节关节腔,剩余三组均给予左膝关节前交叉韧带离断术（anterior cruciate ligament transaction ACLT）。四周后IL-1Ra组给予关节腔内注射IL-1Ra5g／ml,TGF-β1组给予关节腔内注射TGF-β150mg／ml,每周两次,连续四周,正常组及对照组未采取任何措施。术后八周时采用空气栓塞法处死全部实验动物,取股骨远端长约1cm,固定后切片行细胞形态学观察。结果：大体肉眼观察：对照组股骨远端软骨面色颜色变暗并稍显粗糙,可见少量软骨脱落,其余两组关节软骨大体形态均接近正常。镜下观察：TGF-β1组软骨细胞增生明显,软骨细胞排列较正常软骨细胞排列轻度紊乱。IL—1Ra组软骨细胞增生数量未及TGF-β1组明显,软骨细胞排列也不及TGF-β1组规则。IL-1Ra组及TGF-β1组软骨细胞形态接近正常软骨细胞,基质染色接近正常。两组软骨膜表面光滑,无纤维细胞形成,软骨膜下未见纤维化。对照纽软骨细胞数量明显减少且排列紊乱,软骨细胞形态发生改变,可见软骨细胞凋亡,镜下可见软骨细胞核浓缩、裂解,并可见新生软骨形成,突出于正常软骨膜表面,软骨膜表面下方可见血管翳及纤维母细胞形成,出现轻度纤维化。基质染色不均匀且染色较淡。结论：IL-1Ra及TGF-β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生,促进软骨基质合成,延缓骨性关节炎的发病进程.     

应用原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系建立体外骨关节炎模型的效果评价

目的通过比较白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)处理对原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力、炎症因子与炎症通路表达水平变化的影响,为骨关节炎体外研究用细胞提供多重选择。方法免疫细胞化学法与甲苯胺蓝染色分别检测细胞中Ⅱ型胶原与蛋白多糖,鉴定所培养的原代细胞是否为软骨细胞。CCK-8法检测IL-1β(10ng/ml)处理24h、48h、72h对原代软骨细胞增殖活力的影响,IL-1β(1、10、20、40ng/ml)处理24h对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力的影响。IL-1β(10ng/ml)分别处理原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系细胞24h后,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)与基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达水平。Real-time PCR法检测核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)mRNA表达水平。结果所培养的原代细胞为原代软骨细胞。IL-1β(10ng/ml)处理可显著抑制原代软骨细胞增殖活力,但IL-1β(1、10、20、40 ng/ml)处理对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力无明显影响。IL-1β(10ng/ml)处理可使IL-6、MMP-13表达水平及NF-κB mRNA的表达量均显著增加。结论IL-1β作用下原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系均可表现出骨关节炎样炎症反应,二者均可用于骨关节炎的体外实验研究。     

白介素-1β诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理

骨关节炎(OA)是一种退行性病变,表现为局限性、进行性关节软骨破坏及关节边缘骨赘形成,并伴有不同程度的滑膜炎症。软骨细胞是成熟关节软骨中唯一的细胞类型,它负责细胞外基质的合成和更新,并维持基质的完整。目前OA的发病机制尚不明确,但越来越多的研究发现致炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)起着重要的作用。IL-1β能诱导软骨细胞凋亡,其机制有一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等途径。IL-1β也是OA病变进展中破坏软骨细胞代谢平衡的主要细胞因子之一。对IL-1β诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理的深入研究,将有助于新药的研发和骨关节病的治疗。     

白介素1 受体拮抗剂及转化生长因子β1 对兔膝关节骨性关节炎（OA） 的治疗研究

目的:通过关节腔内注射白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)及转化生长因子β1(TGF-β1),观察其对骨性关节炎的治疗作用。方法:16只3-4个月龄新西兰大白兔(雌雄不限)随机分为四组,每组四只,分为正常组,对照组,IL-1Ra组,TGF-β1组,正常组仅打开左膝关节关节腔,剩余三组均给予左膝关节前交叉韧带离断术(anterior cruciate ligament transaction ACLT)。四周后IL-1Ra组给予关节腔内注射IL-1 Ra 5g/ml,TGF-β1组给予关节腔内注射TGF-β1 50mg/ml,每周两次,连续四周,正常组及对照组未采取任何措施。术后八周时采用空气栓塞法处死全部实验动物,取股骨远端长约1cm,固定后切片行细胞形态学观察。结果:大体肉眼观察:对照组股骨远端软骨面色颜色变暗并稍显粗糙,可见少量软骨脱落,其余两组关节软骨大体形态均接近正常。镜下观察:TGF-β1组软骨细胞增生明显,软骨细胞排列较正常软骨细胞排列轻度紊乱。IL-1Ra组软骨细胞增生数量未及TGF-β1组明显,软骨细胞排列也不及TGF-β1组规则。IL-1Ra组及TGF-β1组软骨细胞形态接近正常软骨细胞,基质染色接近正常。两组软骨膜表面光滑,无纤维细胞形成,软骨膜下未见纤维化。对照组软骨细胞数量明显减少且排列紊乱,软骨细胞形态发生改变,可见软骨细胞凋亡,镜下可见软骨细胞核浓缩、裂解,并可见新生软骨形成,突出于正常软骨膜表面,软骨膜表面下方可见血管翳及纤维母细胞形成,出现轻度纤维化。基质染色不均匀且染色较淡。结论:IL-1Ra及TGF-β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生,促进软骨基质合成,延缓骨性关节炎的发病进程。     

前交叉韧带损伤后软骨退变和骨性关节炎发生的分子变化

为了探讨凋亡酶的半胱天冬酶3 (Caspase 3)、促炎细胞因子interleukin-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和基质金属蛋白酶降解酶-13 (MMP-13)的表达水平,来说明前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)损伤后软骨细胞的软骨变性和骨性关节炎的发展情况,本研究通过探讨软骨降解程度与损伤时间或患者年龄之间的关系,应用实时聚合酶链反应检测正常人(n=5)和ACL破裂患者(n=42)软骨细胞中IL-1β、IL-6和MMP-13 mRNA的表达水平,采用Western blotting检测MMP-13和Caspase 3蛋白表达水平。通过趋势分析和相关系数分析,分别得出MMP-13、IL-6、IL-1β基因表达与软骨缺损分级,MMP-13、IL-6、IL-1β基因表达与患者年龄的关系。结果表明,软骨降解程度与损伤时间之间存在相关性。与正常相比,ACL损伤的软骨细胞中,MMP-13、IL-6、IL-1β和Caspase 3的表达水平有显著上调。在ACL缺陷患者中,与ACL缺陷未到18个月的患者相比,在超过18个月的患者中发现MMP-13明显上调,而超过10月的患者软骨细胞中IL-6和IL-1β表达水平要高于未到10个月的ACL缺陷患者。同时,IL-1β、IL-6和MMP-13表达水平和软骨损伤或病人的年龄之间没有关联。研究发现,软骨细胞凋亡、炎症和分解代谢因子水平的升高与损伤时间有关,并可能导致ACL损伤后软骨退变和骨性关节炎的发生。     

聚己内酯/柚皮素纳米纤维膜对白介素1β诱导的体外骨关节炎的作用研究

目的探讨聚己内酯(PCL)/柚皮素纳米纤维膜对白介素1β(IL-1β)诱导SD大鼠软骨细胞退行性变修复作用。方法使用静电纺丝技术分别制作PCL纳米纤维膜,PCL/柚皮素纳米纤维膜,使用扫描电子显微镜(SEM)观察纳米纤维膜的表征。提取3～5 d的SD大鼠软骨细胞,分为空白对照组、骨关节炎(OA)组、骨关节炎加PCL(OA+PCL)组、骨关节炎加PCL/柚皮素(OA+PCL/柚皮素)组,分别处理24 h后进行CCK-8实验检测各组SD大鼠软骨细胞的增殖情况,并进行活/死细胞染色,观察各组SD大鼠软骨细胞的毒性。提取各组SD大鼠软骨细胞的总RNA,使用qRT-PCR检测炎症及软骨标志基因的表达。结果与OA组相比,PCL/柚皮素纳米纤维膜组大鼠的细胞活性较高,细胞数量明显增多,炎症标志基因表达明显降低,软骨标志基因表达明显增高(均P0.05)。结论 PCL/柚皮素能降低IL-1β诱导的SD大鼠体外骨关节炎症标志基因的表达,对SD大鼠关节炎有一定治疗作用,且能上调关节炎细胞中软骨标志基因COL2a1的表达。     

低强度周期性静水压力对人膝关节软骨细胞的影响

目的:探讨低强度周期性静水压力对体外培养的人膝关节软骨细胞增殖、凋亡,以及细胞Ⅱ型胶原分泌表达的影响。方法:体外酶消化法分离培养成人膝关节正常软骨细胞,将培养的第3代软骨细胞分为两组:正常对照组、3.0MPa组压力实验组,应用多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置加载低强度周期性压力,共5d,每天2h。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法和甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,qRT-PCR、Western-Blot检测Ⅱ型胶原的分泌和表达。结果:软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色均显示为阳性。与正常对照组相比,3.0MPa组表现出促进软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡,且Ⅱ型胶原的合成分泌明显升高(P0.05)。结论:通过体外模拟人生理情况下较低强度(3.0MPa)的周期性静水压力对人软骨细胞增殖、凋亡水平及周围基质分泌合成功能的影响,初步证实了较低强度压力有助于软骨自我修复和自身保护作用的发挥。     

MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3及Col-Ⅱ因子在兔软骨细胞损伤后的表达变化

检测MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3及Ⅱ型胶原细胞外基质因子在正常兔关节软骨细胞和划伤后不同时间点的表达变化。在无菌条件下获取兔膝关节软骨细胞,原代体外培养软骨细胞,六孔板内制备细胞损伤模型。用显微镜观察正常细胞和损伤后1 d、3 d和7 d 3个时间点的软骨细胞增殖情况。采用实时PCR检测正常软骨细胞和损伤后1 d、3 d和7 d 3个时间点的基质金属蛋白酶-2、3和9,基质金属蛋白酶抑制物-3及Ⅱ型胶原的m RNA的表达水平。成功分离软骨,经原代培养后成功建立损伤细胞模型。MMP-2损伤后第1天与正常组相比升高,第3天时下降,第7天明显水平最高。与正常组相比,MMP-3在细胞损伤后第1天表达明显下降,随后第3天逐渐下降,第7天与第3天未见明显变化。MMP-9划伤后第1天比正常组升高,第3天上升至最高水平,第7天下降。TIMP-3基因在损伤后第1天与正常组相比明显下降,随后第3天稍有升高,第7天水平最低。Ⅱ型胶原划伤后第1天与正常组相比明显升高,随后第3天呈下降趋势接近于正常组,第7天又呈上升趋势。MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-3因子和Ⅱ型胶原在细胞损伤后的不同时间点有不同的表达行为,这可为调节细胞外基质基因治疗关节软骨损伤选择合适的靶基因和时间窗提供实验依据。     

苦参碱对IL-1β诱导的小鼠体外骨关节炎的作用研究

目的探讨苦参碱对IL-1β诱导小鼠软骨细胞退行性变修复作用。方法提取3～5 dC 57乳鼠软骨细胞,分为空白对照组,骨关节炎(OA)组,骨关节炎加苦参碱(OA+Mat)组,分别处理24 h后,行HE染色,观察各组小鼠的细胞形态及数量,并提取各组小鼠的总RNA,RT-qPCR反应检测炎症及软骨标志基因的表达。结果与OA组相比,OA+Mat组细胞形态与空白对照组一样良好,细胞数量与空白对照组相近,且比OA组多,炎症及软骨标志基因的表达均比OA组高(P0.05)。结论苦参碱能降低白介素1诱导的小鼠体外骨关节炎症标志基因的表达,对小鼠关节炎有治疗作用,且能上调关节炎细胞中软骨标志基因COL2a1的表达。     

GGCX基因在兔骨关节炎软骨退变中的作用机制

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

γ-谷氨酰羧化酶基因过表达对兔骨关节炎软骨细胞分化的影响

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。本研究首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。正常对照组的凋亡率为26.12%,载体组的凋亡率为26.12%左右,GGCX过表达组的凋亡率为18.17%,GGCX过表达可明显减少软骨细胞细胞凋亡(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

TREM1对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响

摘要 目的：探讨髓系细胞表达激发受体分子1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响,以期为骨关节炎治疗提供新的研究方向。方法：使用白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）刺激ATDC5小鼠软骨细胞以模拟骨关节炎软骨细胞炎症,qPCR检测白介素-6（IL-6）表达以验证炎性软骨细胞诱导情况,同时检测目标基因TREM1的表达。为观测抑制TREM1对炎性软骨细胞的影响,将细胞分为对照组、IL-1β组及IL-1β+LR12（TREM1抑制剂）组,分别通过Mito-Tracker染色、TUNEL染色观察三组细胞的线粒体动力学和凋亡情况。接着探究过表达TREM1对正常ATDC5软骨细胞的影响,设置空载质粒组、TREM1过表达组及过表达TREM1+LR12处理组,使用Mito-Tracker染色及TUNEL染色检测三组细胞线粒体动力学和凋亡情况。此外,PCR Array检测过表达TREM1对软骨细胞代谢的影响。结果：与对照组相比,IL-1β组IL-6基因表达增加,表明炎性软骨细胞造模成功;TREM1在IL-1β处理后的骨关节炎细胞中表达升高,使用TREM1抑制剂（LR12）处理可有效抑制TREM1的表达,且能明显抑制软骨细胞的炎性因子IL-6的表达。IL-1β组软骨细胞的线粒体动力学失衡和凋亡增加,而IL-1β+LR12组上述情况得到改善。另外,与空载质粒组相比,过表达TREM1组出现线粒体动力学失衡和凋亡增加,但在TREM1+LR12组软骨细胞中线粒体失衡和凋亡增加得到缓解。此外,PCR Array发现过表达TREM1可引起ATDC5细胞的代谢紊乱。结论：TREM1可一定程度损害软骨细胞线粒体动力学平衡及促进细胞凋亡,靶向TREM1可能为骨关节炎治疗提供新的方向。     

TGF-β1调控GATA3促进骨关节炎中软骨细胞钙化

[目的]探究TGF-β1与GATA3对骨关节炎中软骨细胞钙化的影响。[方法]收集外伤及骨关节炎患者的膝关节软骨组织并分离软骨原代细胞,将软骨细胞分为正常组和研究组。用SB-431542或K-7174干扰软骨细胞中TGF-β1/GATA3的表达。用钙化诱导培养基使软骨细胞发生钙化。通过蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量PCR实验分析软骨细胞中TGF-β1/GATA3的表达。通过茜素红染色统计细胞钙化水平。[结果]与正常组软骨细胞比较,OA组患者软骨细胞TGF-β1和GATA3的表达水平和钙化水平显著增加(1.01±0.02 vs 2.98±0.03;0.91±0.05 vs 2.33±0.11;P<0.05);与PBS组比较,K-7174组软骨细胞的ALP和COLX的表达水平(2.18±0.05 vs 0.91±0.06;2.83±0.03 vs 0.46±0.01)以及钙化细胞数量显著降低(0.63±0.03 vs 0.25±0.01;P<0.05);与PBS组比较,SB-431542组软骨细胞的ALP和COLX的表达水平(1.01±0.02 vs 0.46±0.05;1.05...     

LncRNA MEG3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)人母系表达基因(Maternally expressed gene 3,MEG3)对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:选取我院住院的OA患者和半月板损伤患者各40例,采用RT-PCR检测两组患者软骨组织和细胞中MEG3的表达。在OA软骨细胞中,转染si RNA-MEG3(si-MEG3)或过表达MEG3的慢病毒载体(LV-MEG3),采用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,RT-PCR和western blot检测PCNA、Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达。结果:OA患者膝关节软骨组织中MEG3的表达水平明显低于半月板损伤患者软骨组织(P0.05),同时OA软骨细胞中MEG3的表达水平明显低于正常软骨细胞(P0.05)。OA软骨细胞转染siMEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显下降(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显升高(P0.05),S期细胞比例明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P均0.05)。低表达MEG3能够显著降低Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),增加GSK-3βm RNA和蛋白表达水平(P均0.05)。在OA软骨细胞转染LV-MEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显升高(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显下降(P0.05),S期细胞比例明显增加(P0.05),细胞凋亡率明显减少(P均0.05)。高表达MEG3能够显著增加OA软骨细胞中Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),降低GSK-3βm RNA和蛋白表达(P均0.05)。同时,采用XAV939阻滞Wnt/β-catenin信号通路能够显著逆转过表达MEG3对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论:MEG3在OA患者和软骨细胞中均显著低表达,并能够通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活影响OA软骨细胞增殖和凋亡。MEG3可能成为OA治疗的重要靶分子。     

Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的:研究Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用探讨骨关节炎(OA)发生及进展的可能途径和分子机制。方法:β-catenin过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况.Western blot方法:检测滑膜细胞核内β-catenin蛋白表达。Transwell小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7的变化找出MMP-7变化最明显的时间点。同时在最佳时间点ELISA方法:检测软骨细胞培养上清液CTX-Ⅱ、COMP的水平。结果:慢病毒转染滑膜细胞后茨光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光.Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中β-catenin表达明显上调(P0.01)。通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑制胞体边缘发白壁强度降低。ELISA结果:显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达明显升高,与正常组相比有显著差异(P0.01)软骨细胞上清液MMP-7的变化有一定的时间依赖性在共培养2h、6h、12h时逐渐升高;24h时略有降低且在共培养6h时变化最为明显。而共培养6h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-Ⅱ水平与正常对照组相比均明显升高(P0.01)。结论:β-catenin过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/β-catenin信号通路,Wnt/β-catenin信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜-软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降解这可能是滑膜炎促进OA发生、发展的机制之一。     

TGF-β1对体外培养的关节软骨细胞的作用

以原代培养的软骨细胞为材料,研究了转化生长因子IGF－β1对关节软骨细胞的增殖和软骨特异性基质代谢的作用,结果显示TGF－β1可以刺激细胞外基质中蛋白多糖含量的增加,并可以在转录水平上调节Ⅱ型胶原的表达。TGF－β1可以在体外诱导高密度培养的软骨细胞形成透明软骨样结构。没有用TGF－β1处理的高密度培养细胞不能形成透明软骨样结构,在透射电镜下观察发现其内部结构发生了异常变化。这些结果表明TGF－β1对于支持关节软骨细胞的体外培养具有重要的作用。     

MiR-127-5p通过靶向调节adipoR1促进骨关节炎软骨细胞的增殖

脂联素（adiponection）与骨关节炎（osteoarthritis, OA）的发病密切相关,且主要通过其受体adipoR1发挥作用。而骨关节炎中脂联素的表达是否受miRNA表达的影响却未见报道。本文旨在研究miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞中脂联素及细胞增殖的影响。分离培养人原代OA软骨细胞及对应正常细胞,甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定。 Real-time PCR结果表明,OA软骨细胞中miR-127-5p的表达与正常软骨细胞中的相比较显著下降。MiR-127-5p转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度（P<0.05）,表明adipoR1为miR-127-5p的靶向基因。MiR-127-5p mimic转染软骨细胞后,MTT法研究结果表明,miR-127-5p mimic 可显著促进软骨细胞增殖,Western 印迹结果表明,脂联素及其受体（adipoR1）表达显著上升,p65的表达以及p38、ERK1/2以及IkBα的磷酸化水平显著下降。ELISA结果表明,MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量显著下降。实验结果提示,miR-127-5p通过靶向下调adipoR1及脂联素的表达,促进软骨细胞增殖,并且抑制NF-κB信号通路,进而抑制炎性反应。