应用RAPD技术分析奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的基因多态性(英文)

以随机扩增多态ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）分析了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼两个养殖群体的群体内及群体间遗传关系,并探讨了该技术在种群鉴定中的应用。ＲＡＰＤ引物筛选结果表明,所测试的２０个随机引物中（Ｔａｂｌｅ　１）,除一个引物未扩增出任何片段外,其余１９个引物均扩增出１～１１个大小不等的片段,长度大部分在５００～３０００ｂｐ之间,共扩增出２２０个片段,平均每个引物产生５．５个片段。两群体间共有片段７０条,大部分引物的扩增产物具有种间多态性,种群间相似系数为０．７２７。以筛选的引物对两种群不同个体（Ｆｉｇ．１,Ｔａｂｌｅ２）及种群混合样品（Ｆｉｇ．２,Ｔａｂｌｅ３）进行ＲＡＰＤ分析。结果表明,不同引物在扩增图谱上表现很大差异。奥利亚罗非鱼不同个体间表现为一致的扩增图谱,种内相似系数达１０００,显示了其种群内遗传变异的缺乏;尼罗罗非鱼种内相似系数为０．８２７,个体间存在不同程度的多态性;两个种群间的相似系数分别为０．７６７和０．７４２,表明种间有较高的同源性,遗传距离为０．２３５,略低于国外的报道、此外,两个养殖群体间的扩增图谱比较也暗示了遗传渐渗现象的存在。实验表明,ＲＡＰＤ标记可以作为一种可靠的遗传标记,用于不同鱼     

用RAPD技术对罗非鱼遗传变异的研究及应用

应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术检测了一个奥利亚罗非鱼（au）和湘湖（nx)、美国（nm)、沙市（np）三个尼罗罗非鱼养殖群体（Table1)。在20外引物（Table2）中筛选到12个引物,它们的扩增物显示了罗非鱼和尼罗罗非鱼二者在群体内或群体间存在遗传差异。其中（Fig.1),OPZ06、OPZ16、OPZ12和OPZ19四个引物分别有一个扩增片段具有种的特异性。它们的大小分别是900、1500、1700和730bp。可以作为鉴别罗非鱼和尼罗罗非鱼二者的分子遗传标记,湘湖（nx）、美国（nm）和沙市（np）三个尼罗罗非鱼群体都保留了较高水平的遗传变异。而奥利亚罗非鱼（au）的群体内遗传变异最小。奥利亚罗非鱼（au）与湘湖（nx）、美国（nm)、沙市（np）三个尼罗罗非鱼群体之间的遗传距离分别是0．285、0．262和0．344（Table3）,说明奥利亚罗非鱼（au）和沙市尼罗罗非鱼（np）杂交将可能产生较强的杂种优势。     

微卫星标记分析罗非鱼群体的遗传潜力

利用25个微卫星标记,对奥利亚罗非鱼2个群体["夏奥1号"(ZA)、广西群体(GA)]和尼罗罗非鱼4个群体[埃及品系(ZN)、88品系(XN)、广西群体(GN)、美国品系(MN)]进行检测。共检测到7 775个扩增片段,长度在100~400 bp;等位基因数3~8个不等,共计143个等位基因;平均每个基因座扩增得到5.72个等位基因。各群体平均观测杂合度(H o)在0.7253~0.8160之间,平均期望杂合度(He)在0.5146~0.6834之间,平均多态信息含量(PIC)在0.4212~0.6105之间,平均有效等位基因数(A e)在2.20~3.23之间。ZA与GA遗传相似系数最高(0.9130),ZA与ZN遗传相似系数最低(0.4352)。总的说来,4个尼罗罗非鱼群体的遗传潜力较高,2个奥利亚罗非鱼群体的遗传潜力适中。     

吉丽罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂)及其两亲本遗传变异的微卫星分析

吉丽罗非鱼是由耐盐性较强的萨罗罗非鱼做父本与生长速度较快的尼罗罗非鱼做母本进行杂交、杂交后代自交产生,2009年全国水产原良种审定委员会审定为养殖新品种。为了分析吉丽罗非鱼及其两亲本遗传特性,选择有代表性的6对微卫星引物,对这3种罗非鱼遗传变异进行研究分析。研究结果表明:(1)6对微卫星引物扩增产物片段大小为180～350bp,共发现21个等位基因,鱼类群体间、微卫星座位间及等位基因间都存在极显著差异。(2)有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样指数(H)和多态信息含量(PIC)值等群体遗传多样性指标都是吉丽罗非鱼>尼罗罗非鱼>萨罗罗非鱼,吉丽罗非鱼PIC值达到了0.657,属于高度多态性。(3)吉丽罗非鱼与萨罗罗非鱼的遗传距离要比与尼罗罗非鱼的近,萨罗罗非鱼对吉丽罗非鱼的遗传影响要大于尼罗罗非鱼。     

用RAPD技术对罗非鱼遗传变异的研究及应用(英文)

应用随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术检测了一个奥利亚罗非鱼（ａｕ）和湘湖（ｎｘ）、美国（ｎｍ）、沙市（ｎｐ）三个尼罗罗非鱼养殖群体（Ｔａｂｌｅ１）。在２０个引物（Ｔａｂｌｅ ２）中筛选到１２个引物,它们的扩增产物显示了罗非鱼和尼罗罗非鱼二者在群体内或群体间存在遗传差异。其中（Ｆｉｇ．１）, ＯＰＺ０６、 ＯＰＺ１６、 ＯＰＺ１２和 ＯＰＺ１９四个引物分别有一个扩增片段具有种的特异性。它们的大小分别是９００、１５００、１７００和７３０ｂｐ。可以作为鉴别罗非鱼和尼罗罗非鱼二者的分子遗传标记。湘湖（ｎｘ）、美国（ｎｍ）和沙市（ｎｐ）三个尼罗罗非鱼群体内遗传变异相似性指数Ｓ分别为 ０．７９８、 ０．７９５和０．８２４（Ｔａｂｌｅ ３）。表明：这三个尼罗罗非鱼群体都保留了较高水平的遗传变异。而奥利亚罗非鱼（ａｕ）的群体内遗传变异最小。奥利亚罗非鱼（ａｕ）与湘湖（ｎｘ）、美国（ｕｍ）、沙市（ｕｐ）三个尼罗罗非鱼群体之间的遗传距离分别是０．２８５、０．２６２和０．３４４（Ｔａｂｌｅ ３）,说明奥利亚罗非鱼（ａｕ）和沙市尼罗罗非鱼（ｎｐ）杂交将可能产生较强的杂种优势。     

四个奥利亚罗非鱼群体的微卫星分析

应用筛选到的19对微卫星引物,对四个不同来源的奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）群体（奥利亚罗非鱼83系、奥利亚罗非鱼02系、奥利亚罗非鱼05系和红色奥利亚罗非鱼）的基因组DNA进行PCR扩增,分析其群体遗传结构和亲缘关系。根据几个群体在19个位点上的PCR扩增图谱,统计计算各群体的遗传多样性指数。四个群体的平均观测遗传杂合度值在0．154—0．391间;平均预期杂合度在0．181—0．428间;平均多态信息含量值在0．1513—0．3882间,说明它们的遗传多样性水平较低。遗传偏离指数D的评估结果显示这4个群体有多个位点存在不同程度的Hardy—Weinberg遗传平衡偏离。运用MicroChecker软件进行零等位基因预测,结果显示除红色奥利亚罗非鱼群体外,其他3个群体中均可能存在零等位基因位点。各群体零等位基因的位点数分别为：83系1个,02系3个,05系7个,红奥群体为0。零等位基因位点的存在可能是导致位点发生Hardy—Weinberg遗传平衡偏离的原因之一。4个群体中,05系群体与83系群体间的遗传相似性系数最高（0．9422）,遗传距离最小（0．0596）,说明两者亲缘关系最近;83系群体与红奥群体的遗传相似性系数最低（0．6977）,遗传距离最大（0．3599）,可推断两者亲缘关系最远。根据群体间的遗传距离采用UPGMA法进行聚类,结果表明：83系首先与05系聚类为一支,然后与02系群体聚类,最后与红奥群体聚类。聚类结果说明红奥群体与其他三个群体亲缘关系最远;83系群体与05系群体亲缘关系最近,与02系群体次之。     

奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼rDNA内转录间隔区序列特征

核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列.本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分185序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列.4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1.a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%～69.42%.4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536～540 bp,GC含量为69.42%～70.19%.与b型ITS1相比,a型ITS1在16～31 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTCGGCGC)的插入.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%～57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%～74.26%.奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近.此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1.分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确.     

奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO基因片段的克隆及序列分析

根据其他鱼类DMRT基因中的保守序列设计了一对简并引物,利用RT-PCR扩增了雌雄奥利亚罗非鱼的DMRT基因,并对其扩增产物进行了克隆与测序。结果在雌雄奥利亚罗非鱼个体中获得了两个不同的片段,分别命名为DMO,DMRT1基因。序列同源性分析表明,奥利亚罗非鱼DMRT1,DMO cNA系列的同源性为61.78%,氨基酸同源性为86%,说明了DMRT基因存在性别差异。与尼罗罗非鱼、红鳍东方豚、虹鳟、青鱼将等鱼类DM保守区相比,氨基酸序列同源性为86%-100%,这充分显示了DM-RT基因在进化上的高度保守性。     

应用RAPD技术对不同基因组组合生物型遗传多态性的研究

利用RAPD技术对不同基因组合的鱼类进行了基因组指纹图谱构建,在DNA水平上对基因组成分进行了分析,探讨陈春遗传多态性。PARD结果发现,在26个随机引物扩增的产物中,平均每个个体观察到约142个RAPD标记,单个的扩增图谱（Fig.1)可将红鲫（RA）与其它组合区分开,还可将鲫鲫杂种二倍体（CA)鲫鲤杂种三倍体（CAA）和人工复合三倍体鲤（CCA）区分开;S－8引物（Fig.2)可区分开红鲤（RC）和镜锂（MC）;S－45引物（Fig.3)可区分开RC和CA;S－22引物则可区分开CAA和CCA。六种生物型均存在基因组特异性的图谱即各种独特的“诊断性”图谱,作者由此建立了详细的分子标记检索表（Table1）。通过对RAPD图谱的量化分析。利用UPGMA构建了不同生物型的遗传关系树图,反映了鲤鲫及各种组合生物型之间的遗传相似关系:RC的MC属同一种系,聚为一族;CAA和CA基因组类型相同,聚为一族;CCA虽自成一体,但可与各种生物型内个体间的遗传相似率均大于群体间的（P＜0．05）。此外,本研究还对基因剂量效应对PAPD扩增图谱的影响进行了探讨。综合以上结果,RAPD技术有简捷,灵魂、花费少等特点、在鱼类品系鉴定和遗传多态性研究方面具有血型血清学和蛋白质多态性等其它技术无可比拟的优势。     

奥利亚罗非鱼Piwi基因的克隆与生物信息学分析

Piwi基因是影响鱼类生殖细胞发育的重要因子。通过设计特异引物,以奥利亚罗非鱼的精巢RNA为模板,通过PCR扩增和克隆测序,获得了两种基因序列,分别长2 571 bp和3 204 bp。通过生物信息学分析,表明这两个片段与尼罗罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2相似性都达到99%。通过翻译,Piwil-1和Piwil-2的蛋白序列具有典型的PAZ和Piwi结构域。因此,这两个基因为奥利亚罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2基因。另外,生物信息学分析也表明Piwil-1和Piwil-2在一级结构和二级结构上十分相似,说明在奥利亚罗非鱼基因组中这两个基因分化时间则较短。本研究为后续研究鱼类生殖机理和罗非鱼进化研究奠定了基础。