全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的研究进展

N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac)及其衍生物不仅在人体内发挥重要的生理生化功能,且已经应用到流感的预防和治疗。但已有的N-乙酰神经氨酸生产方法产量低、成本高,限制了其大规模生产和广泛应用。随着分子生物学技术及糖组学研究的发展与成熟,一种新型的生物技术即全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸正成为研究的热点。旨在介绍全细胞催化技术合成N-乙酰神经氨酸的研究进展。     

全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的条件优化

【目的】N-乙酰神经氨酸有多种生物学功能,其在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值。N-乙酰神经氨酸现有的生产方法产量低、成本高,难以满足医药工业大规模的需求,因而急需建立一种经济高效的生产方法。【方法】在前期研究中,构建了一株产N-乙酰神经氨酸的代谢工程菌(Escherichia coliΔnanTEK/pNA),本研究通过单因素试验对工程菌生物转化生产N-乙酰神经氨酸的过程进行优化,包括工程菌细胞培养条件(培养温度和时间)和全细胞生物转化的各种条件(转化温度、时间、表面活性剂等)。【结果】经过条件优化后,建立了全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,使N-乙酰神经氨酸的产量提高到294.39 mmol/L。【结论】该方法具有操作简便、高效和经济的优势,为N-乙酰神经氨酸的规模化生产奠定了基础。     

多细胞耦合转化N-乙酰氨基葡萄糖和乳糖生产唾液酸乳糖

唾液酸乳糖是母乳寡糖(human milk oligosaccharides, HMOs)中含量最丰富的唾液酸化低聚糖之一，对婴幼儿的健康发育有重要作用，但是其目前缺乏高效、廉价的生产工艺。针对该问题，本研究建立了多菌株两步法耦合生物合成唾液酸乳糖方法。第一步构建2株工程菌，大肠杆菌JM109(DE3)/pET28a-BT0453和JM109(DE3)/pET28a-nanA，用于耦合合成中间产物N-乙酰神经氨酸，在2株工程菌株细胞生物量比为1:1，反应时间为32 h的条件下，得到的N-乙酰神经氨酸最高产量为20.4 g/L。第二步向上述发酵液中添加大肠杆菌JM109(DE3)/pET28a-neuA、JM109(DE3)/ pET28a-nst和面包酵母，通过三菌株耦合发酵合成3ʹ-唾液酸乳糖(3ʹ-sialyllactose, 3ʹ-SL)。在底物N-乙酰氨基葡萄糖、乳糖浓度均为200 mmol/L，面包酵母细胞生物量为150 g/L，辅因子Mg²⁺浓度为20 mmol/L的优化条件下，发酵24 h，发酵液中3ʹ-唾液酸乳糖的最高产量达到55.04 g/L，底物N-乙酰氨基葡萄糖的转化率为43.47%。研究结果为低成本生产3ʹ-唾液酸乳糖提供了一条新的技术路线。     

乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在肿瘤转移中的作用及其分子机理

目前研究表明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在肿瘤转移中有重要作用.在恶性肿瘤中, N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ活性增高,其催化产物β1,6分支也增加,β1,6分支与肿 瘤的侵袭转移密切相关.本文综述了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ催化形成N-糖链 β1,6分支的特点以及在N-糖链生物合成中的重要作用;还介绍了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ基因组成和参与其基因调控的转录因子Ets-1,及基因表达组织特异性;着重综述了近年来N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ与肿瘤侵袭转移相关的分子机理的最新研究进展,包括了粘附分子钙粘蛋白(cadherin)和整合素α5β1的作用,修饰表皮生长因子受体调节信号 转导,及通过对上皮衍生的细胞表面丝氨酸蛋白酶matriptase的β1,6分支修饰促进仲瘤的 侵袭等方面.提示有效抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ参与作用的位点,为设计抗肿瘤新药提供潜在的治疗靶点.     

麦胚凝集素的结构及与专一性糖的相互作用

麦胚凝集素(WGA)分子由两个相同原体组成。WGAⅡ的原体为一条171个氨基酸残基的多肽链,肽链可分成四段,各段氨基酸顺序呈明显同系现象,折叠成形态相似的结构域。WGA的高级结构有明显对称性。二原体交界处有两对糖结合部位,能借氢键和疏水相互作用特异地结合N-乙酰葡糖胺和N-乙酰神经氨酸及其衍生物和寡聚糖。WGA与某些细胞上依赖糖的受体作用引起生物效应,其特殊的空间结构是重要的。     

人乳低寡糖的结构及其特殊功能

人乳低寡糖（HMO）由D-葡萄、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-岩藻糖和N-乙酰神经氨酸等5种基本结构构成。基本结构又以不同比例和特殊连接方式形成9种核心结构,再经过多种变化构成人乳中100多种低寡糖。HMO有维护肠道生态平衡、抗御肠道感染、增强人体免疫力,预防癌症发生,防止慢发性结肠炎和促进新生儿大脑发育等功能。     

来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质

葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal(GenBank Accession No.EFS20452.1)构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达.通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现,ShNAL是一个四聚体,裂解方向的最适反应pH为8.0;合成方向的最适反应pH为7.5,最适反应温度为45℃.在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响,高于45℃时,活力迅速下降.该酶在pH 5.0～10.0的环境中比较稳定,4℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上.ShNAL对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分别是(4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.14±3.2) mmol/L,kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s)和0.08 L/(mmol·s).     

聚唾液酸,一种非GAGs、非免疫原性生物材料的应用研究进展

聚唾液酸是一种由N-乙酰神经氨酸连接、电负性的线性同聚物,存在于人体、动物细胞和少数致病菌中,主要以糖蛋白(神经细胞粘附分子)和糖脂形式存在,是一种非糖胺聚糖(GAGs)、非免疫原性、生物可降解的优良生物材料。聚唾液酸可用作组织工程和药物缓释材料,也可以与其它大分子复合形成功能材料。对聚唾液酸生物学功能、发酵生产及应用进行概述,以期为聚唾液酸的进一步应用研究提供参考。     

用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离,利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明,用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸,得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时,对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度;溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案;用此3个方案合成时,产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸,产率59.2%,光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸,产率61.7%,光学纯度为95.7％．     

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11,ACOAT) 是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(D     

N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化及固定化酶性质研究

使用LX-1000HFA氨基树脂对N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)进行固定化,并对游离酶与固定化酶的酶学性质及稳定性进行了对比研究。结果显示,最佳固定化条件为载体投放量5.0 g,固定化时间12 h,缓冲液浓度1.0 mol/L,pH7.5,温度25℃。在此条件下制备的固定化NAL活力最高,比酶活可达200 U/g湿载体。与游离酶相比,最适反应温度提高了5℃,最适反应pH没有变化,温度和pH耐受性明显提升。同时固定化酶储存稳定性和操作稳定性也显著增强,在4℃条件下储存10 d后其酶活仅损失6%,重复使用10次后仍保持初始酶活的80%。因此,该固定化酶具有良好的温度稳定性、pH稳定性、储存稳定性和操作稳定性,为酶法工业化生产N-乙酰神经氨酸研究提供了理论依据。     

合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建

唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能,对其微生物合成方法的研究具有重要的理论和应用价值。克隆和表达来源于Campylobacter jejuni的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(neuC)、乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuA)和来源于Nesseria meningitidis的唾液酸转移酶基因(nst),利用表达载体pSTV29,在大肠杆菌Escherichia coli JM109内构建合成唾液酸乳糖的代谢途径。在接种量2%、装液量50 mL/250 mL三角瓶、摇床转速180 r/min、温度34℃的条件下发酵30 h,并以10 g/L乳糖为底物,利用HPLC检测到唾液酸乳糖的合成量为2.45 g/L,为人乳唾液酸寡糖及其类似物的异体合成提供了新的思路。     

短额负蝗精子发生过程中SBA受体的动态分布

用常规组织学方法观察短额负蝗Atractomorpha sinensis Bolivar精子发生过程中生精细胞的显微结构,并以大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)为探针利用凝集素细胞化学方法研究该过程中N-乙酰半乳糖复合物的分布变化。结果表明,短额负蝗精子发生经历了精原细胞增殖期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精子细胞形成期和精子成熟期5个时期,在这5个时期中各期生精细胞的大小、形态、核染色体等变化明显。在整个精子发生过程中,N-乙酰半乳糖复合物出现于精原细胞期,并于精母细胞期发生明显的修饰和变化,精子形成期和成熟期没有N-乙酰半乳糖复合物的表达。提示,N-乙酰半乳糖复合物的修饰和变化与短额负蝗生精细胞的生长和分化密切相关。     

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶干扰慢病毒载体系统的建立及应用

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT）Ⅲ、Ⅳa和Ⅴ的RNA干扰（RNAi）慢病毒系统,并检测干扰慢病毒在体外小鼠肝癌细胞中对不同GnT表达的抑制作用。方法针对三种基因序列设计合成特异的shRNA序列,并构建干扰慢病毒表达载体,利用病毒包装细胞293T包装生产病毒,感染靶细胞Hca-F后,应用RT-PCR和免疫印迹检测干扰慢病毒对三种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶表达的抑制。结果经测序证实三种干扰慢病毒表达载体构建成功,并获得高滴度的感染慢病毒。干扰慢病毒感染靶细胞后能够有效下调三种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的表达。结论干扰慢病毒可有效地抑制三种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶GnT-Ⅲ、GnT-Ⅳa和GnT-Ⅴ的表达。     

细胞催化技术生产醇类物质的研究进展

全细胞催化作为生物催化的一个重要分支,以完整的细胞为催化剂,避免了细胞裂解和酶纯化步骤,极大地削减了生产成本。同时,细胞壁成分可以保护胞内酶不受外界环境的影响,能够满足对催化剂的低成本和高稳定性的要求。对适宜乙醇、二醇、糖醇等醇类物质生产的菌株以及目前食品、化工工业中利用细胞催化技术生产醇类物质的应用进行综述,探讨提高醇类物质产量的生产策略,以期为细胞催化转化生产醇类物质的研究与工业开发提供参考。     

N-乙酰半胱氨酸体外对流感病毒H1N1的抑制作用

目的探讨N-乙酰半胱氨酸（N—acetylcysteine,NAC）在体外对流感病毒H1N1的抑制作用。方法采用MTT法、鸡胚接种法和免疫荧光法,观察NAC对流感病毒HlM的抑制作用。采用血球凝集试验、神经氨酸酶活性抑制试验和透射电镜负染技术,初步探讨NAC对流感病毒HlM的抑制机制。结果NAC在MDCK细胞上的最大无毒剂量是6．25mg／mL;流感病毒H1Nl在MDCK细胞上的半数致死感染浓度（TCID-50）为1012-2.25／100μ;在三种作用途径下（治疗性给药、预防性给药和直接灭活后给药）,NAC明显抑制了流感病毒HlNl对MDCK细胞的感染,细胞存活率分别为91．88％、93．21％、94．67％,在对照组,流感病毒H1N1感染后的细胞存活率为28．32％,两者相比差异有统计学意义（P〈0．05）;免疫荧光结果显示,与病毒对照组形成的强特异性荧光相比,三种作用途径感染MDCK细胞后的特异性荧光明显减弱;鸡胚培养法的结果显示,NAC明显抑制了流感病毒H1N1在鸡胚内的增殖,实验组血凝效价低于1：2,对照组血凝效价为1：1024;神经氨酸酶活性抑制试验和透射电镜的结果显示,NAC能够明显抑制流感病毒川N1的神经氨酸酶活性,对流感病毒H1N1的病毒体结构也有明显的破坏作用。结论NAC在体外对流感病毒川N1有明显的抑制作用,其抑制机制可能与NAC对流感病毒血凝素和神经氨酸酶活性抑制及病毒体的直接破坏有关。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶的结构和特性

多肽: N-乙酰氨基半乳糖转移酶是催化O-聚糖合成的关键酶.它是一个大家族,拥有悠久的进化历史.随着研究的进展,它的结构和功能也越来越明确,催化特性也有了进一步了解.同时,它还有可能和帕金森病的发病机制有关.     

虎纹捕鸟蛛凝集素-I(SHL-I)的细胞凝集活性分析

采用人红细胞悬液在微量血凝板上测试了 1 1种单糖对虎纹捕鸟蛛凝集素 - I ( Selenocosmiahuwena lectin- I,SHL - I)的凝集活性的影响 .测试的糖类包括 D-半乳糖 ,甲基 -α- D甘露糖苷 ,D-甘露糖 ,D-甘露糖胺 ,D-葡萄糖 ,N-乙酰 - D-葡萄糖胺 ,D-葡萄糖胺 ,L -木糖 ,L-岩藻糖 ,N-乙酰神经氨酸 ,N-乙酰 - D-半乳糖胺 .测试结果表明 ,只有 D-甘露糖胺对 SHL- I的凝集活性表现出明显的抑制作用 .说明 D-甘露糖胺可能是与 SHL- I专一性结合的糖基 .温度适应性实验表明 SHL- I有较高的热稳定性 ,经 1 0 0℃处理 30 min,仍保持大部分凝集活性 .p H适应性实验表明 ,在碱性 p H环境下SHL- I的凝集活性明显下降 .     

高效表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其酶学性质

摘要: 【目的】构建N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶双酶活性表达毕氏酵母重组菌株,并对经纯化的重组蛋白SL2B 进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究。【方法】利用PCR 拼接技术得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546 和木聚糖酶基因xynAS27cd 融合而成的基因Sl2b。构建重组表达载体pPIC9 / Sl2b 转化毕氏酵母,筛选得到同时具有木聚糖酶和N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性的重组子,随后对经硫酸铵沉淀、分子筛纯化后得到的重组蛋白SL2B 进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶     

黏蛋白型O-聚糖在人类肿瘤中的结构异常及生物学功能

黏蛋白是细胞表面的或分泌的、具有高度O-糖基化修饰的糖蛋白.在黏蛋白中,O-聚糖(O-glycan)是通过N-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸或苏氨酸之间形成α连接,该结构即被称为黏蛋白型O-聚糖.黏蛋白型O-聚糖是由多肽∶N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)家族催化起始合成的,近年来,该酶的催化机制及结构特点已成为糖基转移酶研究的热点.在肿瘤中常常伴随着黏蛋白型O-聚糖结构上和数量上的改变,形成肿瘤特异聚糖结构(cancer-associated glycans),如肿瘤Tn和T抗原等.肿瘤特异聚糖使肿瘤细胞的抗原性和黏附能力发生改变,促进肿瘤细胞的恶性增生与转移.而这些肿瘤特异聚糖结构,也为肿瘤的诊断与抗肿瘤药物或疫苗开发提供了理论基础.