三例小麦细胞质雄性不育系线粒体DNA的扩增片段长度多态性分析

细胞质雄性不育是小麦杂种优势利用的重要途径,为了鉴定3例小麦雄性不育系的细胞质类型,对其线粒体DNA(mtDNA)进行扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)分析。文中利用差速离心法和不连续蔗糖密度梯度超速离心法提取纯化小麦线粒体。结果表明:通过该提取方法获得的mtDNA,其质量和纯度能够满足PCR反应和遗传学分析。在64对选扩引物中,筛选到了4对特异性引物,其中引物E1/M7在ms(Kots)-90-110不育系扩增出3条特异条带;引物E4/M2在ms(Ven)-90-110不育系扩增出2条特异条带;引物E7/M6在ms(S)-90-110不育系中扩增出2条特异条带;引物E6/M4在ms(Kots)-90-110不育系中扩增出2条特异条带。这些特异引物可以用来作为鉴定具有粘果山羊草Aegilops kotschyi、偏凸山羊草Ae.ventricosa、斯卑尔脱小麦Triticum spelta 3类不育细胞质型小麦雄性不育系的细胞质分子标记,为研究小麦细胞质雄性不育机理奠定了分子基础。     

离子束介导甘蓝全DNA转化拟南芥菜的分子分析

30 keV的Ar+离子束在1.5×1017 ions/cm2的注入剂量下介导外源甘蓝全DNA导入模式植物拟南芥菜,在94株转化当代植株中,有6株表型产生变异。以其中的一株(T-5)作为研究对象,用80条10碱基随机引物对该株和其子代变异株基因组作随机扩增的多态性DNA分析,引物S176 在T-5和其变异子代T-5-2中扩增出了相同分子量的变异新条带T-5S176-620。T-5S176-620的碱基序列和拟南芥菜基因组序列进行同源比对,结果表明该片段不属于拟南芥菜基因组,Southern杂交实验证明该片段来自供体甘蓝基因组。但是,根据T-5S176-620序列设计的引物不能从甘蓝基因组中扩增出预期长度的DNA片段,结合离子束介导外源全DNA转化的特点和过程,探讨了其中可能的机制。     

热带小奥德蘑的序列特异性扩增标记开发

[目的]为了快速、准确地对热带小奥德蘑JZB2115055进行鉴定和保护,该研究开发了该菌的序列特异性扩增(SCAR)标记。[方法]采用26个ISSR引物对19个小奥德蘑属菌株进行PCR扩增,以引物P826扩增时,JZB2115055在700 bp～1 000 bp之间出现了一条特异条带,获得此条带的DNA序列并设计特异性引物对P826-1-2XF/R。[结果]以19个小奥德蘑DNA为模板,P826-1-2XF/R为引物在JZB2115055中能够特异性地扩增出2条条带,长度分别为431 bp、537 bp;该引物在2～19号菌株中扩增不出目的条带或者扩增条带在2 000～5 000 bp之间。[结论]开发了热带小奥德蘑JZB2115055的SCAR标记,能够在该菌中特异性地扩增出431 bp和537 bp大小的条带,而其他18株菌株不能扩增出特异条带,此标记能够快速、准确地进行该菌的鉴定和保护。     

利用SSR标记对垂穗披碱草和老芒麦进行物种鉴定和遗传变异分析

垂穗披碱草(Elymus nutans)和老芒麦(Elymus sibiricus)皆为花序下垂类披碱草属物种,高海拔地区的E.sibiricus的部分变异类型也具有小穗紧密排列等特征,与E.nutans在形态学性状上具有较多的交叉,造成野外种质资源采集时进行直接的田间鉴定存在困难。本研究利用12对小麦族SSR引物对8份垂穗披碱草和10份老芒麦种质进行遗传变异和物种鉴定分析,UPGMA聚类分析表明供试材料明显可依据物种差异划分成两大类,主向量分析(PCo A)与聚类分析的结果保持一致。种质间遗传相似系数分析和分子方差分析(AMOVA)也表明种间变异远高于种内。另外,本研究筛选出3对引物,ESGS79和ESGS155能够在垂穗披碱草材料中扩增出特异性条带,Xgwm311能够在老芒麦材料中扩增出特异性条带,这3对引物能够作为区分垂穗披碱草和老芒麦的依据,为野外种质资源的收集以及田间育种工作提供指导。     

黑麦特异重复序列pSc119.1在姊妹T1RS·1BL易位系中的变异

根据公布的黑麦特异重复序列pSc119.1设计特异引物, 分别对两套姊妹T1RS·1BL易位系川农12(CN12)、川农17(CN17)、川农18(CN18)和96Ⅰ176-1、96Ⅰ176-3的基因组DNA进行扩增。从CN12、CN17、CN18的基因组中都能扩增出目的片段, 在96Ⅰ176-1的基因组中, 除目的片段外, 还扩增出了一条非目的片段, 但在96Ⅰ176-3的基因组中没有扩增出产物。Southern blot分析表明, pSc119.1序列并未从96Ⅰ176-3的基因组中消失。将CN12、CN17、CN18的目的片段回收克隆后, 对每个片段各随机挑取10个克隆进行测序, pSc119.1序列在3个品种中都发生了变异, 且在CN18中的变异程度最大。所测的序列多数与原序列达94%和95%的相似性, 在这些序列中, 碱基的改变具有一定的规律, 即多数为转换, 少数为颠换, 且变异碱基和变异位置具有较高的一致性。远缘杂交后代的进化可能是一个持续过程, 姊妹系内的株系之间某些性状存在差异, 这些差异很可能与重复序列的变异有关, 这为后生遗传效应机制的研究提供了有用的材料。     

柑橘mRNA差异显示技术体系建立

明柳甜橘是从春甜桔自然芽变中选育出来的新品种,本研究以春甜橘和明柳甜橘的叶片为试验材料,首先提取春甜橘和明柳甜橘叶片的总RNA,经3种锚定引物(HT11A,HT11C,HT11G)反转录成3类cDNA,再利用相应的锚定引物和34个随机引物(HAP1-HAP34)组成引物对,反转录cNA进行差异显示PCR扩增,将扩增产物经6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染,获得了比较清晰的差异条带,然后回收差异条带并进行克隆,初步分离获得一些春甜橘和明柳甜橘差异基因,建立了柑桔mRNA差异显示技术,为进一步分析导致柑橘芽变的分子机理奠定基础.     

用随机扩增多态性DNA产物做探针产生鸡的DNA指纹图

我们用12个随机扩增多态性DNA(RAPD)引物对来自不同品系的4只鸡进行了RAPD分析,在扩增出的共99条带中,表现多态性的带为38条,占总带数的38％.回收了4个表现个体特异性的RAPD产物,当用鸡的基因组总DNA探针与它们杂交时,其中3个表现阳性,说明RAPD方法扩增出的高变异产物含有重复序列.用含重复序列的个体特异性RAPD产物作探针,与无关个体鸡基因组DNA的HaeⅢ酶切产物进行DNA印迹,获得了变异性较高的DNA指纹图谱.因此,高变异的RAPD产物可以有效地用作DNA指纹探针.     

粘类小麦细胞质雄性不育系的RAPD分析

利用250条10-聚寡核苷酸随机引物对具粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、易变山羊草(Ae.variabilis)、偏凸山羊草(Ae.ventricosa)和二角山羊草(Ae．bicornis)细胞质不育系及其保持系5-1的总DNA进行了RAPD多态性分析,其中31条引物对4种不育系及其保持系总DNA均无扩增,217条引物扩增条带完全相同。有2条随机引物在2种不育系之间有特异的扩增片段,其中引物S22在偏凸山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出分子量约为1600bp的特异带,引物S202在粘果山羊草细胞质雄性不育系基因组DNA中扩增出约1300bp特异带。线粒体基因组DNA的RAPD分析表明,4种不育系及其保持系mtDNA存在明显的差异。证明了S22—1600为偏凸山羊草细胞质不育系及其mtDNA基因组DNA的RAPD特异片段．S202—1300可能为粘果山羊草细胞质不育系及其ctDNA基因组DNA的RAPD特异片段。     

小麦抗锈变异体的RAPD分子验证

将长穗偃麦草DNA导入普通小麦甘麦8号,在其后代出现广泛变异,并从中选育出两个优良的抗条锈病的姊妹变异体。本实验以原供体和受体作为对照,对两个变异体进行了RAPD分子验证,其主要结果为：两个变异体的大多数引物扩增产物带型类同于受体,而与供体带型差异显著;在81个引物中有2个引物检测出了DNA的多态生,主要表现为变异体90001-17中1条带活性不仅超过受体,而且也远超过90001-1的相应带活性,同时两个变异体都出现了1条供体和受体都没有的新带,分子量约为1044bp;另一引物扩增后,变异体90001-17和90001-1分别出现了2条和1条特异性带,分子量约为1073bp和1020bp,此外在两个变异体阳极端带明显被激活,而受体中1条分子量约为968bp的带在变异体中活性降低或消失等。从而表明抗锈变异体9001-17和90001-1的形成是供体的DNA片段进入受体基因组的结果。     

一种随机引物联合多特异性DNA片段检测结核分支杆菌的新方法

目的:针对目前结核性疾病实验室诊断的局限性,探索一种更为敏感和特异的结核分枝杆菌DNA检测新方法。方法:选取10株江苏地区流行的结核分支杆菌(MTB)菌株,选取临床其他常见菌株及分枝杆菌菌株作为对照组,分别提取DNA作为随机引物的模板。参考国内、外文献设计12条随机引物,并分别对MTB及对照菌株进行单个引物随机扩增,2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离并切胶纯化,通过TA克隆将纯化片段连接到质粒pEASYTM-T5 Zero并进行测序,通过BLAST-nr比对验证是否为MTB DNA片段。按照所确定的MTB片段序列,在其内部设计、合成一对特异性引物。用此特异性引物扩增对应的随机引物扩增产物,获得MTB特异性条带图谱。并将该方法检测的敏感性和特异性与临床上常用的real-time PCR进行比较。结果:经BLAST-nr比对,随机引物IS986F,S535及IS986R扩增的条带与MTB DNA有高度同源性(均为99%)。随机引物IS986F、S535和IS986R分别联合其特异性引物可以检测稀释105倍、105倍和103倍的MTB DNA,其特异性分别为100%、90%和80%。常规real-time PCR可检测出稀释104倍的MTB DNA。结论:随机引物IS986F联合其特异性引物检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性优于S535、IS986R两组,特异性为100%,且灵敏度优于常规real-time PCR法。