乙型肝炎病毒表面抗原基因在酵母SUC2启动子-信号顺序控制下的表达

酵母SUC2基因克隆YFD6的DNA用核酸酶BAL31从SUC2基因的BamHI切点进行酶解,加上BamHI接头后,自连环化,得到的一个缺失质粒YFD6A21保留sucz基因动子-信号顺序以及氨基端22个氨基酸残基的编码顺序。将带有HBsAg基因的BamHI片段插入YFD6 A21的BamHI切点,使HBsAg基因suc2基因融合,然后将重担质粒引入酵母将酵母转化子在葡萄糖阻遏及去阻遏条件下生长,然后测定细胞内、周质空间和培养基中的HBsAg量。我们只能在葡萄糖去阻遏条件下检测到HBsAg的表达,几乎全部表达的HBsAg位于细胞内。     

HBsAg基因在酵母细胞中的表达

先前从酵母染色体[DNA中得一个作用较强的启动基因片段,使HBsAg基因在其控制下,构建了大肠杆菌一酵母细胞穿梭质粒。这种质粒转化的酵母细胞能生产和装配HBsAg颗粒。经放射免疫分析,超离心沉降研究和电子显微镜观察,酵母产生的HBsAg颗粒与人血清中的HBsAg颗粒十分相似。     

新生儿国产重组(酵母)乙型肝炎疫苗免疫效果考核

为了考核新生儿接种国产重组(酵母)乙型肝炎(乙肝)疫苗后的免疫效果,并与血源乙肝疫苗效果比较。对1997年出生并接种重组(酵母)乙肝疫苗的新生儿隔年随访一次,采血检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg),乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc),1998年以后对乙肝免疫人群开展急性乙肝发病监测。显示五年期间3次随访检测HBsAg阳性率平均为1.5%,较免前本底的HBsAg阳性率呈较大幅度下降,疫苗保护率为83%(95%可信区间为76.97%~89.02%),无论母亲HBsAg阳性或阴性,使用不同乙肝疫苗的儿童HBsAg阳性率没有统计学差异。接受重组(酵母)乙肝疫苗免疫的对象中,无一例急性乙肝病例报告。重组(酵母)乙肝疫苗有较好的近期保护效果和免疫原性,与以前使用血源乙肝疫苗效果相当。     

HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究

为探索一种提高乙肝病毒表面抗原免疫原性的新方法,用PCR和基因重组技术构建HBsAg与GM-CSF的融合基因,并在毕赤酵母中分泌表达HBsAg/GM-CSF(S-GM)融合蛋白。表达产物用SDS-PAGE检测,W estern b lot分析,离子交换柱纯化后免疫昆明鼠,ELISA检测免疫小鼠血清中抗HBsAg的抗体水平。结果显示S-GM融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达,离子交换柱一步纯化即可得到纯度达90%以上的S-GM。W estern b lot分析S-GM可分别与抗HBsAg及抗GM-CSF的抗体特异结合。ELISA检测发现第一次免疫后4w出现抗HBsAg的抗体,加强免疫后融合蛋白组几乎全部阳转,且抗体水平较HBsAg组(P=0.009<0.05)及HBsAg和GM-CSF的混合物组(P=0.032<0.05)高。HBsAg/GM-CSF融合蛋白能够在毕赤酵母中表达,且可增强HBsAg的免疫原性,为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的肽质量图谱分析

重组人源性抗HBsAg Fab抗体具有较好的特异性和抗原结合活性,为了更好的阐明毕赤 酵母表达的重组人源性抗HBsAg Fab抗体的性质,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)对重组Fab抗体的分子质量和肽质量图谱进行了分析。结果显示,毕赤酵母表达的重组 人源性抗HBsAg Fab抗体的分子质量为50678．49Da,与根据其一级结构计算的理论分子质量相 比多2763．84 Da,显示酵母表达的重组Fab抗体为糖蛋白。用胰蛋白酶酶解重组Fab抗体后进行 MALDI-TOF-MS分析显示,大部分的酶解肽段均能检测出来。结果表明毕赤酵母表达的重组Fab 抗体与预期的结构一致。     

荧光定量PCR法检测重组汉逊酵母中HBsAg基因的拷贝数

重组汉逊酵母基因中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和检测传代稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为研究和分析重组基因的重要内容.利用快速、灵敏的荧光定量PCR法检测外源基因HBsAg拷贝数,以Mox基因为内源参照基因,通过梯度稀释法,建立了Mox基因和HBsAg基因的循环数(Ct值)与起始模板数的相关标准曲线,其相关系数分别达到0.9996和0.9982.通过比较目的基因HBsAg和内源参照基因Mox在同一荧光强度下出峰的循环数,获得了目的基因HBsAg在重组汉逊酵母中的拷贝数为39.发酵前后HBsAg基因在重组汉逊酵母中稳定存在,发酵前后拷贝数相差均小于6.2%.本方法快速、简便、准确,可以满足基因拷贝数检测的需要.     

基因工程乙肝新型疫苗（汉逊酵母表达系统）的开发

HBsAg不同成份在多条生物细胞系统中已表达成功,但至今仅哺乳动物细胞（CHO,C127等）和酿酒酵母表达系统占领了大部分市场,我们的临床观察也证明了酵母重组疫苗对HBeAg和HBsAg双阳性母亲所生的新生儿免疫保护效果最好,近年来又发展了汉逊酵母表达系统,其特点为30个adw2HBsAg基因拷贝整合于该酵母染色体中,含有MOX,FMD等高效启动子,能利用甘油,甲醇为能量为源进行高密度发酵,每升发酵液的细胞干重达100g以上,工程菌发酵生产稳定性好,HBsAg颗粒表达最达400ug/ml,最终纯化的HBsAg达60ug/ml, 其单位产量比酿酒酵母表达系统高约10倍,小鼠实验证明该系统表达的HBsAg诱导体液和细胞免疫应答较好,值得开发出产品,适合于我国广大农村使用,在发展基因工程乙肝疫苗时也应考虑研究增强抗原细胞免疫工程菌的构建和疫苗佐剂。     

一条新的柱层析纯化路径对HBsAg免疫原性的影响

摘要目的：建立一条新的毕赤酵母表达乙肝表面抗原（HepatitisBantigen,HBsAg）柱层析纯化方法,保持HBsAg结构完整性和提高免疫原性。方法：毕赤酵母发酵料液经过菌体破碎、聚乙二醇沉淀、疏水层析、超滤和凝胶分子筛精纯,收集HBsAg合格样品液适当稀释后加入铝佐荆吸附,制成乙肝疫苗半成品免疫BALB／c小鼠。结果：纯化产物经SDS-PAGE银染鉴定得单一条带,分子量在23kD左右,凝胶成像软件分析纯度超过95％;该纯化方法得到的HBsAg颗粒电镜观察得平均直径为22nm病毒样颗粒,结构较均一完整;自制疫苗免疫小鼠后,其血清抗体水平高于葛兰素史克生产的Engerix—B（安在时）,存在显著性差异（P〈0．05）。结论：通过该方法纯化的HBsAg结构完整性良好,疫苗免疫效果优于酵母表达的Engerix—B,纯化路径简单高效,易于放大用于工业化生产。     

HBsAg生化性状对乙型肝炎疫苗效力影响的研究

比较研究了重组酵母HBsAg P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度对乙型肝炎疫苗效力的影响。分别用HPLC及SDS－PAGE法检测重组酵母乙型肝炎疫苗HBsAg的P24亚基在还原条件下降解和P24亚基间二硫键桥联程度,并检测乙型肝炎疫苗小鼠体内效力（ED50值）和体外相对效力（RP）,分析HBsAg的P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度对乙型肝炎疫苗效力的影响。结果表明HBsAgP24亚基还原条件下降解成分Sub-P24的相对含量在5．2％－31％间,P24亚基间二硫键桥联型HBsAg颗粒相对含量在41．9％－71．8％范围内与疫苗的实验室效力无关。所生产重组酵母乙型肝炎疫苗HBsAg的P24亚基间二硫键结合及其还原条件下降解程度不影响乙型肝炎疫苗实验室效力。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式,将人源性抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤（Pichia pastoris）酵母GS115菌株的染色体上,经甲醇诱导,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段,表达量达50～80mg/L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析,纯化出了纯度较高的Fab产品。