登革病毒血清型特异单克隆抗体的制备和鉴定

登革病毒 (Dengue virus,DENV) 是全球传播最为广泛的虫媒病毒,由于缺乏快速鉴别感染病毒血清型的诊断技术,导致异型交叉感染引起重症登革出血热病例居高不下。为实现免疫学方法快速鉴别诊断不同血清型DENV感染,本研究采用哺乳动物细胞293T表达并纯化了4种DENV血清型NS1蛋白,免疫小鼠后通过杂交瘤技术制备了针对NS1蛋白的单克隆抗体。利用酶联免疫吸附方法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫斑点杂交试验 (Dot blotting) 以及蛋白质免疫印迹试验 (Western blotting) 确认所制备的单克隆抗体能够有效识别天然病毒NS1以及重组NS1蛋白。获得的单克隆抗体包含2株可识别1–4型DENV NS1蛋白的通用型抗体及3株分别针对DENV-1、DENV-2和DENV-4的血清型特异抗体。以所制备的DENV NS1抗体为基础,采用双抗体夹心ELISA可快速鉴别不同血清型DENV。DENV血清型特异单克隆抗体的制备和甄别DENV血清型ELISA方法的建立为快速鉴别感染DENV血清型的临床诊断奠定了基础。     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV- 1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病 [1,2].     

登革2型病毒E蛋白结构域III的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不…     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒（Dengue virus,DENV）属于黄病毒科（Flaviviridae）,黄病毒属（Flavivirus）,为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型（DENV-1,2,3,4）,主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病。     

登革病毒交叉反应性单克隆抗体的制备及特异性研究

近年来全球登革疫情严峻,而针对登革疫苗的研究一直进展缓慢,尚无有效的疫苗或治疗性药物,被动免疫逐渐成为研究热点。本研究旨在通过制备登革病毒(Dengue virus,DENV)交叉反应性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)并鉴定其特异性,期望为登革病毒的被动免疫治疗及疫苗的研发提供一定的物质基础和参考。本研究采用4种DENV联合免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用有限稀释法对阳性孔细胞进行筛选,获得DENV交叉反应性mAb。采用腹水诱生法对其中的一株mAb进行了大量制备和纯化,鉴定其Ig亚类,通过间接法酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了mAb对4种血清型DENV的有效滴度,通过间接免疫荧光试验(Immunofluorence assay,IFA)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)对其特异性进行鉴定,通过噬斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)检测了mAb的中和能力。结果显示成功获得3株DENV交叉反应性mAb,分别为1G2、2F1、3G9。其中1G2株抗体的Ig亚类为IgG2b,纯化后抗体对DENV1～DENV4的有效滴度分别为1∶640、1∶640、1∶320、1∶320。IFA实验表明所获得的单抗1G2是针对DENV的特异性抗体,与黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)之间无交叉反应性;WB结果表明单抗1G2识别的目的蛋白是E蛋白(55～60kD)。PRNT结果表明单抗1G2对4种血清型DENV具有一定的中和活性,DENV1至DENV4的PRNT50分别为1∶80、1∶80、1∶80和1∶40。本研究成功筛选并鉴定到一株可交叉识别4种登革病毒E蛋白的mAb。     

Ⅲ型登革病毒在THP-1细胞上的ADE模型建立

登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合症(dengue shock syndrome,DSS)等重症的主要原因。采用不同稀释度的Ⅱ型登革病毒prM前膜抗体与分离自云南西双版纳重症病人的Ⅲ型登革病毒复合感染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR发现亚中和浓度prM前膜抗体诱发THP-1细胞液中更高浓度的病毒载量。在THP-1细胞系上的研究可为后续研究登革病毒ADE打下坚实的基础。     

登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用

观察登革 2型PrM基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型PrM基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型PrM基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义PrM基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义PrM基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .为探讨登革病毒防治新途径奠定了基础     

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 ,为双价登革核酸疫苗的研究奠定基础     

福建省白纹伊蚊中登革病毒的分离与鉴定

近年来福建省登革热(Dengue fever,DF)输入性病例持续存在,且登革热的主要传播媒介白纹伊蚊在全省内广泛分布,为了解福建省福州市登革热的媒介白纹伊蚊携带登革病毒(Dengue virus,DENV)状况,2017年10月7日在福州市台江区元一花园小区内开展伊蚊监测,采用双层叠帐法捕获255只白纹伊蚊蚊体研磨液上清提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测DENV特异性核酸,将检测阳性的蚊体研磨液上清接种C6/36细胞进行病毒分离,成功分离到1株DENV病毒株mosquito13/Fujian/2017;经实时荧光RT-PCR法鉴定所分离病毒株的血清型为I型;利用型特异性引物通过RT-PCR扩增病毒E基因并测序进行分子遗传特性分析;E基因核苷酸和氨基酸同源性分析显示,该毒株与2017年10月17日同小区本地登革热病例血清中分离得到的登革毒株E基因序列完全一致,与越南2014年分离株KT825033/Vietnam/2014核苷酸(99.7%)和氨基酸(99.8%)同源性最高;系统进化树分析表明所分离登革病毒毒株的基因型为I型,与东南亚地区的越南,泰国,柬埔寨等国家进化关系相近,可能输入来源于东南亚国家。本研究证实了登革热外潜伏期的存在以及白纹伊蚊在登革热疫情传播过程中的媒介作用,提示在登革热的防控工作中媒介登革病毒监测、检测的重要性,也提示福建省需要加强输入来源监测,特别是东南亚入境人员的监测。     

登革病毒诱导人单核细胞VEGF的表达及机制

研究登革病毒(Dengue virus,DENV)感染对人单核细胞中血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelialgrowth factor,VEGF)表达的影响,并检测分析可影响VEGF表达的天然免疫信号通路。通过Real-time PCR检测,发现不同型DENV(DENV1、DENV2、DENV3)感染THP-1细胞均可诱导VEGF mRNA表达水平呈时间依赖性增加;而DENV2感染也可上调VEGF在原代单核细胞中的表达。通过RNAi技术沉默Toll样受体3(TLR3)及接头蛋白IPS-1,发现DENV感染诱导的VEGF表达明显下调;而ERK、JNK及NF-κB等信号通路的抑制也可下调VEGF的表达水平。本研究证明,DENV感染可诱导人单核细胞中的VEGF高表达,而VEGF高表达依赖于TLR3及IPS-1信号通路的激活,提示VEGF可能是治疗登革出血热的一个靶点。