小地老虎隐花色素基因cryptochrome1和cryptochrome2的克隆及mRNA表达分析

隐花色素(cryptochrome,cry)是一类广泛存在于生物体内的蓝光和近紫外光受体,介导生物对蓝光的一系列反应并能导引生物钟。本研究利用RT-PCR和RACE方法获得了小地老虎Agrotis ypsilon cry1和cry2基因,分别命名为Aycry1和Aycry2。Aycry1基因(GenBank No.JQ616846)读码框1 587 bp,编码528个氨基酸,预测分子量60.5 ku,等电点6.68。Aycry2基因(GenBank No.JQ616847)读码框2 439 bp,编码812个氨基酸,预测分子量92.1ku,等电点8.45。保守区分析表明:Aycry1和Aycry2均含有FAD结合位点的PHR区域和C末端保守区域。氨基酸序列比对分析表明,小地老虎的AyCRY1和AyCRY2分别与其它鳞翅目昆虫的CRY1和CRY2有很高的一致性,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera的一致性最高,分别为89.5%和73.8%。NJ聚类分析结果表明昆虫含有两类CRY,即CRY1和CRY2,它们可分别以目为单位进行聚类,其中AyCRY1和AyCRY2分别与其它鳞翅目昆虫的CRY1和CRY2聚到一起。以室内饲养的小地老虎为材料,以3 h为间隔检测了Aycry1和Aycry2的24 h昼夜表达变化,结果表明这2个基因均表现出一定的昼夜节律性。Aycry1和Aycry2表达趋势白天高于晚上,表达峰值出现在ZT7(Zeitgeber time)。方差分析其昼夜波动差异不显著。     

八字地老虎和粘虫蜕皮激素接受子3(HR3)基因cDNA序列的克隆与序列分析

蜕皮激素接受子3(hormone receptor 3,HR3),是一种蜕皮调节转录因子,调控蜕皮过程中相关基因的表达,是蜕皮级联反应中的关键因子。本文以八字地老虎Agrotisc-nigrumL.和粘虫Mythimna separata Walker预蛹期幼虫为材料,分别提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫蜕皮激素接受子3(HR3)的5′非编码区和完整开放读码框在内的cDNA序列,其中八字地老虎的HR3 cDNA序列含有1729个碱基,包括一个1533个碱基的开放阅读框,编码一个含510个氨基酸的蛋白,分子量约为57.5ku。粘虫的HR3cDNA序列含有1743个碱基,包括一个1536个碱基的开放阅读框,编码一个含511个氨基酸的蛋白,分子量约为57.9ku。这2种昆虫HR3 cDNA序列推导的氨基酸序列均具有昆虫核受体超家族特征性结构域,与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的蜕皮激素接受子3的氨基酸序列高度同源。获得的基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,八字地老虎HR3登录号为GU188853,粘虫HR3登录号为GU188854。     

小地老虎几丁质酶基因的克隆与序列分析

利用昆虫几丁质酶对几丁质的调控作用破坏几丁质新陈代谢的平衡来防治害虫, 在生物防治策略中具有很大的发展潜力。从处于预蛹期的小地老虎Agrotls ipsilon (Hufnagel)体中肠内提取总的RNA, 经反转录, 利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了几丁质酶基因的cDNA序列。该基因序列已经登录GenBank并获得登录号为EU035316。该序列长度为2 823个碱基, 含有一个1 674个碱基的开放读码框。开放读码框编码558个氨基酸残基, 预测的分子量为62.5 kDa, 等电点5.12。推导得到的氨基酸序列含有2个N-位糖基化位点,20个O-位糖基化位点, 含有2个几丁质酶所具有的保守序列：N-端的催化区和C-端的几丁质结合区。氨基酸序列与其他昆虫, 特别是鳞翅目昆虫的几丁质酶高度同源。     

小地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及mRNA组织特异性表达

β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本文以小地老虎Agrotis ipsilon Hufngel预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到其β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。该序列含有2701个碱基,包括一个1788个碱基的开放阅读框,编码一个含595个氨基酸的蛋白,分子量约为68.3ku,等电点为5.48。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶高度同源。基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU985280。该基因在小地老虎取食期和预蛹期的马氏管、中肠、脂肪体、体壁和去中肠虫体中均含有mRNA水平的表达。     

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

小地老虎UV视蛋白基因的克隆及序列分析

视蛋白是感光物质的重要组成成分,是动物感知周围光环境的重要途径之一。本文以小地老虎(Agrotis ypsilon)3日龄成虫为材料,利用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆得到小地老虎UV视蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明,小地老虎视蛋白基因的cDNA序列1 632 bp,包括一个1 140 bp的完整开放阅读框架,编码379个氨基酸,理论蛋白分子量(Mw)41.50 ku,等电点(pI)7.56。GenBank登录号为JN185654。UV视蛋白包括7个跨膜拓扑结构和一个G蛋白偶联受体家族,第107位赖氨酸与UV视蛋白的紫外敏感性有重要关系。同源性分析显示,小地老虎UV视蛋白基因与其他昆虫的UV视蛋白基因具有较高同源性。本研究对深入探究UV视蛋白在动物夜行生活中的作用具有重要意义。     

蓝光受体CRY1和CRY2对拟南芥钾吸收影响的研究

以拟南芥野生型Col-4和蓝光受体突变体cry1,cry2和cry1cry2为材料在蓝光下进行缺K+处理,cry1cry2的下胚轴及根的伸长受抑制程度最大.经过对K+充足条件下的Col-4,cry1,cry2和cry1cry2的钾元素含量和持水性检测.以及采用定量PCR对K+转运栽体和离子通道相关基因如AKT1,AtKC1,AKUP1等表达水平的分析,发现cry1cry2的钾元素含量最高、持水性最低,且其K+转运载体和离子通道相关基因的表达量也最高.该结果说明蓝光下CRY1和CRY2的缺失对K+的吸收起促进作用.     

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。 本研究利用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta (Guenée)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列, 该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明, HassPBP2开放阅读框全长450 bp, 编码149个氨基酸残基, 推测编码蛋白的分子量为16.9 kD, 等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明, 该基因由3个外显子和2个内含子组成, 内含子的长度分别为90和261 bp。氨基酸序列联配分析表明, 此序列具有气味结合蛋白的典型特征, 与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间, 其中与棉铃虫Helicoverpa armigera PBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescens PBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示, HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达, 在蛹中期开始表达, 并一直持续到成虫中期, 且只在雌、雄成虫触角中表达。     

甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白基因的克隆与序列分析

肌动蛋白是细胞骨架微丝的主要组成成分,在肌肉收缩、细胞骨架形成、细胞移动等方面起重要作用。以鳞翅目夜蛾科昆虫甘蓝夜蛾Mamestra brassicae L.和八字地老虎Agrotis c-nigrum 3龄幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫的肌动蛋白的cDNA序列,甘蓝夜蛾肌动蛋白的cDNA序列含有1441个碱基,而八字地老虎肌动蛋白的cDNA序列含有1411个碱基。2种昆虫的该基因的cDNA序列均包括1个1131个碱基的开放阅读框,编码1个含376个氨基酸的蛋白。甘蓝夜蛾肌动蛋白分子量约为41.8kDa;八字地老虎肌动蛋白分子量约为41.9kDa。Prosite软件分析结果表明,甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白氨基酸序列中存在3个肌动蛋白特征片段。GenBank数据库搜索及序列比对结果表明,甘蓝夜蛾肌动蛋白属于肌肉特异型肌动蛋白,八字地老虎肌动蛋白属于细胞质特异型肌动蛋白。2个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,甘蓝夜蛾肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035314,八字地老虎肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035315。利用RT-PCR技术在八字地老虎4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了肌动蛋白基因在mRNA水平的表达。     

灰飞虱海藻糖酶基因的克隆及RNA干扰效应

RNA干扰（RNAi）不但可以用于研究基因的功能, 还可以通过沉默靶标基因干扰特定的生命过程。因此, 通过深入研究, 发掘高效专一性靶基因和RNAi技术, 有可能开辟针对性的害虫RNAi防控新途径。本研究通过灰飞虱Laodelphax striatellus转录组数据分析并结合RACE技术, 克隆了灰飞虱两种海藻糖酶的全长基因, 分别命名为LSTre-1和LSTre-2, 其GenBank登录号分别为JQ027050和JQ027051。它们均具有海藻糖酶基因的典型特征, 与已报道的其他昆虫的海藻糖酶基因具有很高的相似性, 并表现出一定的虫种亲缘关系。其中LSTre-1为水溶性海藻糖酶基因, 全长2 042 bp, 开放阅读框编码602个氨基酸, 前端有25个氨基酸的信号肽, 但无跨膜结构域; LSTre-2为膜结合型海藻糖酶基因, 全长2 619 bp, 开放阅读框编码618个氨基酸, 前端有26个氨基酸的信号肽, 有2个疏水性跨膜结构域。利用喂食法研究2种海藻糖酶基因dsRNA对灰飞虱的致死效应, 发现靶向水溶性酶基因的干扰效应略高于靶向膜结合型的, 但两种海藻糖酶基因的dsRNA都可以显著抑制灰飞虱海藻糖酶基因的表达, 降低其活力, 还能显著抑制试虫的生长, 大幅增加试虫死亡率。 结果提示, 通过适宜途径干扰海藻糖酶基因可以开发防治灰飞虱的新途径。     

家蚕生物钟基因Bmcryl与Bmcry2的克隆及生物信息学分析

隐花色素基因(cryptochrome gene,Cry)是已确认的主要生物钟基因之一,它广泛分布于细菌和真核生物中.昆虫Cry基因分为Cry1,和Cry2两类,果蝇只有Cry1,蜜蜂等膜翅目昆虫只有Cry2.为了研究鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori的昼夜生物钟分子调控机制和昆虫CRY蛋白的进化,本研究克隆了家...     

奥利亚罗非鱼Piwi基因的克隆与生物信息学分析

Piwi基因是影响鱼类生殖细胞发育的重要因子。通过设计特异引物,以奥利亚罗非鱼的精巢RNA为模板,通过PCR扩增和克隆测序,获得了两种基因序列,分别长2 571 bp和3 204 bp。通过生物信息学分析,表明这两个片段与尼罗罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2相似性都达到99%。通过翻译,Piwil-1和Piwil-2的蛋白序列具有典型的PAZ和Piwi结构域。因此,这两个基因为奥利亚罗非鱼的Piwil-1和Piwil-2基因。另外,生物信息学分析也表明Piwil-1和Piwil-2在一级结构和二级结构上十分相似,说明在奥利亚罗非鱼基因组中这两个基因分化时间则较短。本研究为后续研究鱼类生殖机理和罗非鱼进化研究奠定了基础。     

节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843~897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为: JQ029719,JQ046392~JQ046405),分别编码280~298个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变。利用14个新氨基酸序列与乳糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换。与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起。     

稻纵卷叶螟氨肽酶N基因的克隆及时空表达分析

【目的】昆虫中肠氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是Bt杀虫蛋白的重要受体之一,与Bt蛋白的杀虫机制及昆虫对Bt蛋白的抗性密切相关。为阐明稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenee)APN基因的功能及明确Bt蛋白对稻纵卷叶螟的毒力机制,本研究系统开展了稻纵卷叶螟中肠APN基因的克隆及时空表达分析。【方法】通过简并引物PCR结合RACE技术克隆并获得4条稻纵卷叶螟APN基因的cDNA序列全长,采用实时定量PCR技术研究了APN基因在稻纵卷叶螟不同虫态及幼虫不同组织中的时空表达情况。【结果】经NCBI同源比对分析,认为这4个基因分属于。4PN基因家族的不同类别,分别将其命名为CmAPN1(GenBank登录号:HQ853294)、CmAPN2(GenBank登录号:HQ853295)、CmAPN3(GenBank登录号:KJ143755)、CmAPN4(GenBank登录号:HQ853296)。序列分析表明,CmAPN1-4 cDNA序列全长分别为:3 698、3 478、3 150和3 149 bp,开放阅读框分别为:3 045、2 877、3 045和2 862 bp,分别编码965、958、1 014和952个氨基酸。其推导的氨基酸序列具有鳞翅目昆虫氨肽酶N的典型结构特征,即含有糖基化位点、N-末端信号肽序列、谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN、锌结合位点HEX_2HX_(18)E、C-末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。实时定量研究表明,CmAPNs在幼虫中的表达量显著高于卵、蛹和成虫;在幼虫中,CmAPN7的表达水平明显低于CmAPN22-4,且其在不同龄期中的表达差异显著;CmAPN2-4的表达量随幼虫龄期的增加而增加;CmAPNs在幼虫肠道组织中的表达量显著高于其它组织器官,且CmAPN1和CmAPN2分别在中肠和后肠中呈现高水平表达,CmAPN3在前、中肠内均高水平表达;但CmAPN4在各个组织器官中的表达均保持较低水平。【结论】CmAPNs基因在稻纵卷叶螟的不同虫态和不同组织中呈现了差异显著的时空表达,采用RNA干扰方法进行CmAPNs基因功能研究时,要选择适宜的虫态和虫龄进行干扰。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843 ～ 897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为:JQ029719,JQ046392～JQ046405),分别编码280 ～298个氨基酸.序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变.利用14个新氨基酸序列与乳糜泻( celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换.与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起.     

彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因SsLRP的克隆和分析

根据彩叶草叶片小型EST库中一条具有1个富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）结构域的EST序列,采用RACE与文库结合的方法,克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA,SsLRP（LRR-Related Protein）（GenBank登录号FJ787729）。SsLRP cDNA全长1024bp,包含一个657bp的ORF框,编码218个氨基酸。其5’-UTR区含有2个终止子TAG,3’-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域,具有5个保守的LRR结构域,多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明,SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级结构预测表明,SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关,推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-PCR分析表明,SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式,在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达,在受菌核病感染植株的茎和叶中表达上调。     

小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析

依赖于DNA甲基化的基因表达调控在植物生长发育过程中发挥重要功能,而DNA甲基转移酶是调节DNA甲基化模式的功能蛋白之一。本研究采用RACE技术克隆了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的包含完整编码区的cDNA序列,并系统分析了该基因的结构特征及其在小麦生长发育过程中的表达特性。结果表明,TaDnMT2的cDNA序列为1321bp（GenBank登录号：JN642641）,其中5′-和3′-UTR（非翻译区）分别为84和115bp、ORF（开放阅读框）1122bp;TaDnMT2编码的氨基酸序列包含2个S-腺苷甲硫氨酸结合域（I和X）、甲基转移酶活性位点（IV）、靶胞嘧啶结合位点（VI）、中和DNA骨架负电荷域（VIII）和靶位点识别区（IX）6个高度保守域,属于DNA甲基转移酶家族的DnMT2亚类;三维结构预测显示,TaDnMT2蛋白可以形成包括7个β-折叠和4个α-螺旋的特定空间结构。表达特性分析的结果表明,TaDnMT2基因在‘京841’小麦不同发育时期的叶中表达量均较高,且其在三叶龄期和五叶龄期的表达量受春化处理的影响;在种子发育过程中,该基因在授粉后5d的种子中表达量较高,随着种子发育进程的推进其表达水平呈逐渐下降趋势;在不同发育时期的根系中,TaDnMT2基因均具有较高水平的表达,且在分蘖期根系中的表达量最高。推断TaDnMT2基因可能在小麦生长发育过程中发挥重要功能。