SARS 冠状病毒 S 蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图

严重急性呼吸综合征 (SARS) 是一种新出现的人类传染病,该病的病原是 SARS 冠状病毒 (SARS-CoV). S 蛋白是 SARS 冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用 . 研究表明 S 蛋白与受体结合的核心区域为第 318 ~ 510 氨基酸残基的片段 . 首先克隆并用 pGEX-6p-1 载体融合表达了该受体结合结构域,并且通过蛋白质印迹分析表明,该受体结合结构域融合蛋白能被 SARS 康复患者血清和 S 蛋白特异的单克隆抗体所识别 . 为了对这一区域进行抗原表位作图,进一步设计了一套 23 个覆盖受体结合结构域的长 16 个氨基酸残基的部分重叠短肽,并进行了 GST 融合表达 . 用免疫动物血清和单克隆抗体 D3D1 对 23 个融合蛋白进行蛋白质印迹和 ELISA 免疫反应性分析,结果鉴定出两个抗原表位 SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349) 和表位 D3D1 (K447LRPFERDI455). 其结果对进一步分析 S 蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有一定意义 .     

ACE2在SARS发病中作用的研究进展

重症急性呼吸综合征（SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的一种急性传染病,在其序列被测出后几个月内人们就找到了SARS-CoV的受体血管紧张素转换酶2（ACE2）。因病毒受体与病毒入侵细胞密切相关,因而有必要深入研究ACE2与SARS-CoV之间的关系。本文总结了ACE2在各组织器官的分布及功能,分析了ACE2基因的变异与病毒进入及SARS疾病严重程度之间的关系、ACE2基因的表达水平与病毒进入及SARS疾病严重程度之间的关系。这些研究将为理解SARS-CoV与ACE2之间的相互作用及设计针对ACE2的抗SARS药物提供重要的理论依据。     

SARS冠状病毒S受体结合区蛋白片段在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的:利用Bac-to-Bac1杆状病毒系统,在sf9昆虫细胞中表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)的S受体结合区蛋白片段,并对其免疫原性进行研究。方法:将S蛋白的受体结合区基因片段定向克隆至转座载体pFast-Bac1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,用抗生素平板筛选重组杆粒。脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液。利用SARS病人恢复期抗血清做ELISA和Western印迹,分析重组蛋白的抗原性。结果:ELISA和Western印迹表明,在sf9昆虫细胞中表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白可与SARS病人恢复期抗血清发生特异反应。结论:获得了在昆虫细胞内表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白,并证明该蛋白有可能用于SARS感染的抗体检测,为SARS-CoV免疫机制及其疫苗的进一步研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

导致严重急性呼吸综合征(sevcre acute rcspiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)。SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S-protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白己成为SARS研究的主要热点。     

SARS和MERS中和抗体假病毒检测方法的建立

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均属冠状病毒科(Coronaviridae),能够引起人类严重疾病,特别是SARS-CoV可以导致严重急性呼吸综合征,而且容易造成暴发式流行,引起社会恐慌。本研究利用含有SARS-CoV和MERS-CoV棘突蛋白(Spike protein,S)基因的表达质粒pcD-NA3.1-SS、pcDNA3.1-MS,成功构建了高滴度假病毒,在此基础上通过对病毒接种量进行优化,建立了稳定可靠的假病毒中和抗体检测方法,并通过检测SARS恢复期病人血清以及免疫后小鼠血清对方法的特异性、稳定性以及重复性进行分析,充分证明了该方法是有效的血清中和抗体的检测手段。本研究成功构建了不依赖于BSL-3级生物安全条件的SARS和MERS假病毒,不仅可应用于血清中和抗体检测,还为后续单克隆抗体及抗病毒药物筛选和评价、疫苗研发及病毒感染机制研究等奠定了基础。     

SARS-CoV 基因组编码蛋白研究进展

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)2002年底暴发于中国广东,后蔓延至全球的传染性疾病．其病原体为一种新型的未知冠状病毒,基因组长度约30 kb,预测具有14个开放读码框．至今为止,对 SARS 冠状病毒(SARS-COV)基因组编码蛋白质的研究已取得显著进展,其研究主要集中在复制酶 1a/1b、结构蛋白及“附属”蛋白(SARS-CoV 特异性蛋白)结构与功能的研究．以 SARS-CoV 的蛋白组成及功能研究为主要内容,系统介绍了 SARS-CoV 蛋白质研究进展．     

SARS冠状病毒的刺突蛋白

严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS corona-vims,SARS-CoV)引起的呼吸系统疾病。SARS-CoV的刺突蛋白(spike protein)具有S1和S2两个独特的功能结构域,研究发现两者都是进行疫苗和抗体研究的理想和有效的靶点。对非典疫苗的研究生产非常有价值,对预防和治疗SARS也有重大意义。     

蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1利用小鼠ACE2受体研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)是一种感染人类的高致病性病毒,由蝙蝠SARS样冠状病毒(SL-CoV)演化而来。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV受体,影响病毒宿主范围、致病性和种间传播。先前研究表明,SARS-CoV和一些SL-CoV株(如WIV1)可以有效利用人、果子狸、蝙蝠ACE2入侵细胞,而SARS-CoV可以低效利用小鼠ACE2。啮齿动物种类多,分布广,包括多种重要的试验动物模型,不过SL-CoV利用啮齿动物ACE2的研究较少。本研究通过假病毒感染试验,比较了SARS-CoV BJ01株和SL-CoV WIV1株利用人类、果子狸、蝙蝠、小鼠ACE2及其突变体进入细胞的效率,并利用蛋白结合试验比较了BJ01和WIV1受体结合结构域(RBD)结合不同ACE2及其突变体的能力。结果显示,SL-CoV WIV1可以有效利用小鼠ACE2进入细胞,且WIV1 RBD与小鼠ACE2结合效率与人和果子狸ACE2相同,强于蝙蝠ACE2;而不同物种ACE2的L440P突变能显著降低其与BJ01及WIV1的RBD结合的能力,抑制假病毒入侵。研究结果表明,小鼠ACE2是SL-CoV WIV1的功能受体,且ACE2的L440是影响病毒入侵的关键氨基酸位点。本研究有助于进一步了解SL-CoV的受体识别、跨种传播机制,对今后类似冠状病毒的防控具有重要意义。     

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30~60aa、170~184aa、301~320aa和360~422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30~60aa、90~120aa、204~214aa和320~360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30~60aa、150~160aa和301~360aa。含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60~214aa)和N185(30~214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据。     

SARS-CoV的分子生物学研究

SARS-CoV是引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的病原体．更多地了解SARS-CoV的基因组、蛋白结构以及它与其它冠状病毒的关系,将有助于SARS疾病的防治．     

单克隆抗体夹心ELISA检测SARS病毒抗原的研究

目的:建立单克隆抗体(McAb)夹心ELISA法,用于检测SARS病毒(SARS-CoV)抗原。方法:用间接夹心ELISA法筛选捕捉和标记用单克隆抗体的组合,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),优化后用于检测SARS-CoV。结果:从12株抗SARS-CoV鼠单克隆抗体中筛选出2A3/1C5组合用于捕捉SARS-CoV,1A5/1B4组合标记HRP作为指示抗体。优化后2A3/1C5的最适工作浓度为1∶4000,HRP-1A5/1B4的最适工作浓度为1∶2000。本方法检测SARS-CoV的敏感度为105pfu/mL。结论:单克隆抗体夹心ELISA法可特异性检测SARS-CoV抗原。     

针对SARS冠状病毒重要蛋白的siRNA设计(英)

RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种特异性地导致转录后基因沉默的现象,在哺乳动物细胞中小分子干扰RNA双链体(small interfering RNA duplexes, siRNA duplexes)可以有效地诱导RNAi现象,为一些疾病的治疗开辟了新的途径.针对SARS冠状病毒(SARS coronavirus, SARS-CoV)中编码5个主要蛋白质的基因,用生物信息学的方法设计了348条候选siRNA靶标.在理论上,相应的siRNA双链体能特异地抑制SARS-CoV靶基因的表达,同时不会影响人体细胞基因的正常表达,这为进一步siRNA类药物的实验研究提供了理论基础.     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的研究进展

核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子。最近的亚定位研究表明,它主要定位到细胞质,核仁内也有较少的分布。SARS-CoVN蛋白参与SARS-CoVRNA合成的调控以及核衣壳的形成,并能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,类泛素蛋白化干扰宿主细胞分裂,在缺乏生长因子的情况下诱导细胞凋亡。     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Western blotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoV N蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位.结果显示(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoV N蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoV N蛋白的aa 30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoV N蛋白的aa 170-184.这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料.     

人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究

严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)或称传染性非典型肺炎,已严重威胁人民健康和生命安全。快速研制一种可用于紧急预防SARS病毒感染的基因工程抗体预防制剂迫在眉睫。为此,运用噬菌体表面呈现技术,从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库,并筛选获得37株特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体,其中ll株人源抗体结合基因工程重组的SARS病毒核(N)蛋白,其中的1株在Western blot分析中与SARS病毒结合,识别SARS病毒N蛋白线性位点。对所获抗体的功能鉴定及基因分析正在进行中。人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得,将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径。     

冠状病毒的新成员--SARS-CoV的基因组特性

2003年3月,人类发现一种新的冠状病毒SARS-CoV,这种病毒是非典型性肺炎(SARS)的病原体。SARS-CoV的基因组序列已经由包括中国科学家在内的全世界的科研人员测定完成。该文对国际报道的SARS病源的基因序列进行了收录,阐述了SARS-CoV基因组的基本特性：SARS-CoV的基因组长约28-30kb,与冠状病毒科的基因组长度相符合,其中包括11个编码序列,基因组的组织方式也与其他冠状病毒类似,从表面蛋白(S蛋白)、外膜蛋白(M蛋白)和核蛋白(N蛋白)上看,SARS病毒与其他冠状病毒的对应蛋白进化关系接近。同时发现,在某些区域,SARS病毒的基因序列与其他冠状病毒存在相当大的差异,具有自身比较保守的基因组序列结构。而且氨基酸的序列也与其他冠状病毒有很大程度的不同。基因信息的冗余分析表明,SARS-CoV具有较低的冗余度,即发生变异的可能性比较大。虽然SARS-CoV外表与冠状病毒类似,亲缘关系未超出冠状病毒科界限,但由于蛋白基因与氨基酸的序列与其他冠状病毒有本质不同,因此可能不是其他冠状病毒的变异体,而是一种与冠状病毒类似、但早已独立存在、此前未被人类所认识的新病毒。     

SARS病毒受体ACE2的克隆、原核表达及其功能区鉴定

ACE2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)是SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome associatedcoronavirus,SARS-CoV)的主要受体。此研究旨在鉴定ACE2的SARS-CoV受体功能区,为进一步阐明SARS-CoV与细胞间的相互作用机制及研制抗病毒药物等提供理论依据。利用RT-PCR从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩增ACE2基因,其中N端片段ACE2A1-367(102~1 210nt)不包括ACE2的酶活性位点(1 223~1 237nt,或374~378aa),而C端片段ACE2B335-805(1 101~2 524nt)包括ACE2的酶活性位点。扩增片段克隆入pMD-18T,并进行测序鉴定。进一步构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白分子量为65kD和77kD,主要以包涵体形式存在。Western blot证实表达产物具有免疫学活性。将纯化的包涵体蛋白质复性后进行Western blot分析,证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(~65kD)能与SARS-CoV S1蛋白特异结合,而pGEX-ACE2B表达的蛋白(~77kD)不能与S1蛋白结合。结果表明,ACE2的受体活性与酶活性位点无关,受体功能区在ACE2 N端367个氨基酸内。     

新型冠状病毒（2019-nCoV）治疗药物体内外研究及药物研发进展

2019年12月以来,中国湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒感染的肺炎患者,随着疫情的蔓延,中国其他地区及境外也相继发现了此类病例。2020年1月12日,世界卫生组织(WHO)将该新病毒暂定命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。2019-nCoV是继SARS冠状病毒(SARS-CoV)、MERS冠状病毒(MERS-CoV)之后发现的一种具有高传染性且可以引起重症呼吸道疾病的新型病毒,临床尚无特效治疗药物。本文结合临床治疗、体内外的研究对相关指南推荐的治疗药物及药物研发进展进行综述,旨在为2019-nCoV病毒感染的肺炎患者的临床治疗提供借鉴。     

SARS冠状病毒N蛋白与γ血红蛋白的相互作用

目的:研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)与γ血红蛋白的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验验证SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白存在相互作用,并通过Western印迹检测SARS-CoV N蛋白对细胞内γ血红蛋白表达量及稳定性的影响。结果:SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白的相互作用能使SARS-CoV N蛋白抑制γ血红蛋白在293细胞中的泛素化,提高γ血红蛋白在293细胞中的稳定性,从而使γ血红蛋白在细胞内的表达量显著提高。结论:SARS-CoV N蛋白能与γ血红蛋白在细胞内形成复合物,为揭示SARS-CoV在婴幼儿群体中致病率较低的机理提供了实验基础。     

SARS冠状病毒的分子生物学研究

严重急性呼吸系统综合征(SARS)是2002年底爆发于中国广东,后蔓延全球的传染性疾病。其病原体为一种未知的新型冠状病毒,章从SARS冠状病毒的蛋白构成和功能研究、SARS冠状病毒感染机制(表型变化,受体)、SARS冠状病毒分子进化这几个方面对现有研究进展做一综述。