大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变

大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序.本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N 5个突变体.通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析,结果显示所构建突变体的Km值上升约2~5倍,比活力下降至野生型SI比活力的11.8%~25.3%.HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp,导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92,并伴随一个未知寡糖出现.Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升,异麦芽酮糖比例下降.但是突变体D329N反应产物比例没有变化.以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用,并对酶的产物特异性产生影响.本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础.     

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基因克隆表达及其酶学特性研究

通过PCR克隆得到了不包括信号肽序列的109～1803bp大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基因,以pQE30为表达载体可以在大肠杆菌中高效表达SI基因,但容易形成包涵体。通过降低诱导剂IPTG至10μmol／L,28℃低温诱导表达可以改进表达产物的可溶性。重组SI的最适pH为6．0,最适反应温度为30℃。测定的Km为46．8mmol／L,Vm甜为152．2u／mg。重组SI对麦芽糖、海藻糖、棉子糖、三氯蔗糖及廿甲基葡萄糖苷等均不起作用,只利用蔗糖为底物转糖苷,也可以水解对硝基苯酚-α-葡萄糖苷。同时发现重组SI具有转化异麦芽酮糖生成海藻酮糖的活性。