观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣绿色管状花苞片叶片黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

苎麻小分子G蛋白Racl基因的克隆及表达分析

植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白,我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因eDNA,．5部分序列,设计引物后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明,所克隆的RaclcDNA全长为l043bp,包括594bp开放阅读框、214bp的3’端非编码区和235bp的5’端非编码区,能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的效应因子结合位点、GTP／GDP结合位点和碱性氨基酸区,c末端具有保守的异戊烯基化位,CSIL。采用半定量RT-PCR分析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况,结果表明Racl基因在苎麻根、茎、叶中均有表达,其中在叶中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中,Racl基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Racl基因表达,表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。     

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

苦荞查尔酮合成酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因（CHS）的全长DNA序列和cDNA开放阅读框（ORF)序列. 序列分析表明,苦荞CHS DNA序列（GU172165）全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区（HM852753）全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS. 生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列（GFGPG）、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点. 半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子＞叶＞茎＞花＞根＞成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性.     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

鳜肌肉生长抑制素Myostatin cDNA克隆与组织表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜(Siniperca chuatsi)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)cDNA序列,并分析了该基因的结构特征和亲缘关系。鳜MSTN cDNA序列全长2627bp,包括5′端非翻译区117bp、3′端非翻译区1376bp和开放阅读框(ORF)1134bp,共编码377个氨基酸,含22个氨基酸的信号肽。鳜MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析表明,鳜与其他鱼类聚为一支。RT-PCR分析表明,鳜MSTN在成体不同组织中的表达情况不同,其中,卵巢、肾、眼、肌肉、心、脑、皮肤和胃中有表达,肝胰脏未见表达。     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR 克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHAR dehydroascorbate reductase 基因的 cDNA 与 DNA 全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导 PCR 的染色体步行技术（genome walking）克隆了其上游 644bp 的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长 1486bp,存在两个内含子,DNA 编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明：BoDHAR与同源基因AT1G195701cDNA 序列有 82.3% 的一致性,推导的氨基酸序列有 79.6% 的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明：BoDHAR 在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

鹤望兰类黄酮3′,5′-羟化酶基因SrF3′5′H的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类黄酮生物合成途径关键基因SrF3′5′H。该cDNA全长1 766 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 509个碱基,编码503个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,SrF3′5′H编码的氨基酸序列与已报道的其他植物的F3′5′H蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰SrF3′5′H与非洲紫罗兰蛋白亲缘关系较近。应用半定量PCR分析表明,SrF3′5′H在始花期转录水平达到最高,且在蓝色花瓣中表达最高,在黄色花萼中几乎没有表达。     

Isolation and Gene Expression of Yellow Grouper Ferritin Heavy Chain Subunit After Lipopolysaccharide Treatment

Ferritin is a ubiquitous and conserved iron storage protein that plays a central role in iron metabolism. The ferritin heavy chain subunit (FerH) homolog was isolated from yellow grouper (Epinephelus awoara) spleen using suppression subtractive hybridization and RACE-PCR. The nucleotide sequence of FerH full-length cDNA was 1173 bp and contained an open reading frame of 534 bp, encoding a putative protein of 177 amino acids. The encoded protein shows 78-94% identity with homologs. Based on phylogenetic analysis, yellow grouper FerH is highly conserved throughout evolution and is closer to European seabass than to other species. RT-PCR analysis demonstrated that FerH was widely expressed in various healthy tissues and significantly up-regulated in liver, spleen, and anterior kidney by lipopolysaccharide. The results suggest that yellow grouper FerH may play a role in immune response.     

蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的克隆及表达分析

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框（ORF）为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点（pI）为5.53;利用在线软件分析表明,该蛋白既不是分泌型蛋白也不是膜蛋白;同源性比对结果表明,该蛋白与其他真菌中的氰化物水合酶蛋白的同源性较高,具有高度保守的催化三联体特征。用qRT-PCR方法分析了该基因在蝗绿僵菌侵染昆虫过程中的表达情况,结果表明,MaChy在蝗绿僵菌侵染穿透昆虫体壁阶段的表达量最高,约为体内阶段表达量的2.5倍,推测该基因可能在蝗绿僵菌穿透昆虫体壁的过程中起重要作用。     

大黄鱼PPAR β全长cDNA的克隆和组织表达

利用RT-PCR和SMART RACE的方法从大黄鱼肝脏中克隆了PPARβ全长cDNA。该序列长3390bp,5′端非翻译区146bp,3′端非翻译区1711bp,开放阅读框1533bp,可编码一个由510个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质分子量为57.2kDa、等电点为6.46。氨基酸序列分析表明,PPARβ基因具有较高的保守性,大黄鱼PPARβ与花鲈、金头鲷、欧鲽、大西洋鲑、红鳍东方鲀、人、黑猩猩、牛、兔及小鼠等10个物种的同源性为72%~91%,其中与花鲈同源性最高,为91%。用RT-PCR法检测PPARβ基因的组织表达,结果表明该基因在大黄鱼肌肉、眼、脾、肾、肝、鳃、心、肠和脑等9个组织中均有表达,其中肝脏组织表达量最大,肌肉最少。     

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用。本研究将该基因序 列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA： 该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp, 编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19.6kD,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达。     

苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。