转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(Nicotianatabacum L.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)及石蒜凝集素基因(lra).通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株.Western blot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同.对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔3:1的分离比方式遗传.抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用.首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性.石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用.     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

抗烟青虫转基因烟草的培育

烟青虫属鳞翅且(Lpidoptera)昆虫。前人研究表明,苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中的Bt毒蛋白对其具有很强的毒杀作用。设法将Bt基因导入到烟草中,是防治这类虫害的一种有效途径。80年代后期以来,为了提高Bt基因在植物中的表达水平,在编码区密码子的优化、编码顺序的改进和高效启动子的选配方面．都有了很快的发展。有些经过部分改进或人工全合成的Bt基因,还被先后导入到番茄〔1.2〕、烟草〔2-4〕、棉花〔5.6〕、玉米〔7〕、水稻〔8〕等重要作物中。迄1995年止．在美国获准可供商业用的Bt毒蛋白转基因作物已有槔花、玉米和马铃薯等〔9〕。在烟草中迄今未见有Bt毒蛋白转基因株达到生产实用水平的报道。本实验试图通过农杆菌介导法,将密码子经过优化的Bt基因cryIA(b)及cryIA?〔10〕叫导入离体培养的烟草叶片,然后使之再生,形成转基因植株,再从其后代中选育出既保留原品种优良农艺性状,又具有对烟青虫稳定抗性的转基因株,以期提高该品种的稳产性,降低杀虫农药成本。保护烟田的良好生态环境。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

质粒pLS9含有1．5kb的编码菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。经限制酶切后克隆到植物表达载体的35S启动子和PolyA终止子之间。经农杆菌介导转化烟草,获得90多株抗卡那霉素再生植株。经PCR检测证明60％以上再生植株含有BADH基因。转基因植株经Western blot,BADH酶活性测定,BADH酶活性特异性染色法检查和耐盐性分析,证明菠菜BADH基因在烟草正常表达。在叶绿体和胞液中均有BADH酶存在。转基因植株能耐较高浓度盐。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。     

转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(NicotianatabacumL.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptII)及石蒜凝集素基因(lra)。通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株。Westernblot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同。对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔31的分离比方式遗传。抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用。首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性。石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用。     

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。     

果聚糖蔗糖转移酶基因的克隆及耐盐转基因烟草的培育

用PCR方法克隆了枯草杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB),将其与克隆自酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羧肽酶A的液泡引导信号序列连接得到嵌合基因。测序验证后．插入含NPTⅡ基因的植物双元表达载体pBin438中,经农杆菌介导转化烟草。部分经卡那霉索筛选的抗性芽能在含1％NaCl的Ms培养基上正常生根,而未转化芽不能生根或根生长缓慢。转基因小苗移入盛蛭石的花盆并浇灌含1％NaCl的hoagland＇s营养液,17d后,其中一些转基因烟草植株生长良好,而未转化苗出现明显萎蔫。PR扩增及Nonhem分析证实SacB基因已导入转基因植株并得到转录。此结果表明SacB基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。