中间锦鸡儿CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢

目的:R2R3-MYB类转录因子参与调控植物初生和次生代谢。方法:从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)干旱转录组数据库中搜索并克隆了一个R2R3-MYB基因,命名为CiMYB15(GenBank登录号MH678649);将CiMYB15基因编码区转入野生型拟南芥中,利用分光光度法测定了野生型和转基因拟南芥中总黄酮含量,并用qRT-PCR检测了转基因植物中At CHS基因的表达情况。同时采用染色体步移法克隆了CiMYB15基因的启动子序列。结果表明:(1) CiMYB15基因g DNA长度为1 960 bp,包含三个外显子(134、131和521 bp)和两个内含子(281和893 bp);开放阅读框长度为786 bp,编码262个氨基酸。(2)克隆得到1 580 bp的启动子序列,序列中主要包含损伤诱导元件G-box和P-box、盐诱导作用元件GT1-motif、参与干旱诱导的反应元件MBS,以及真菌侵害应答元件BOX-W1、植物-病原菌互作元件EIER;此外,还包含调节黄酮合成基因的MYB转录因子的结合位点。(3) CiMYB15基因的表达受到紫外胁迫的诱导。(4) CiMYB15基因过表达株系的总黄酮含量高于野生型。(5)过表达植物中At CHS基因的表达量亦高于野生型。以上结果说明,CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢。     

中间锦鸡儿CiMYB68基因克隆及表达分析

该研究以中间锦鸡儿(Caragana intermedia)为材料,利用RACE技术克隆了CiMYB68基因的全长序列。对CiMYB68的基因组DNA和cDNA全长分析显示,CiMYB68基因无内含子,开放阅读框为852bp,编码284个氨基酸。预测CiMYB68基因编码的蛋白质等电点为8.95,分子量约为31 459.4Da。序列比对和系统进化分析表明,该蛋白和大豆的GmMYB68一致性最高,达到67%。构建了CiMYB68基因与GFP融合表达质粒,激光共聚焦显微镜观察发现,融合蛋白定位于细胞核。用实时荧光定量PCR技术对在不同胁迫条件下CiMYB68基因的表达检测结果表明,在干旱和低温处理下CiMYB68均受到不同程度的诱导,暗示CiMYB68基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

棉花GhMYB113基因的克隆与表达分析

该研究利用序列拼接并结合RT-PCR技术,从棉花叶片中克隆了1个MYB基因的cDNA序列,命名为GhMYB113。序列分析表明,该基因开放阅读框为738bp,编码246个氨基酸,含有2个MYB结构域,属R2R3-MYB类型转录因子。该基因的基因组序列长1 927bp,由3个外显子和2个内含子构成。氨基酸序列比对发现该蛋白与其他物种的MYB蛋白有较高的一致性。系统进化分析显示,棉花GhMYB113与现代杂交月季亲缘关系最近。qPCR分析发现,该基因在棉花根中优势表达,在干旱、高盐及低温胁迫后表达量均发生变化,推测GhMYB113可能在植物响应干旱、高盐及低温等非生物胁迫过程中起作用。     

黄芪AmMYB44基因的克隆与表达模式分析

以黄芪转录组测序获得的一条MYB基因为基础,进行克隆、生物信息学分析和荧光定量分析。克隆得到cDNA序列1 296 bp,其中包含一个长度为1 200 bp的开放阅读框,编码一个由399个氨基酸组成的蛋白质,命名为AmMYB44。预测黄芪MYB44蛋白的分子量为43.392 kD,等电点为6.39,平均亲水数是-0.459,不稳定系数为46.08,属于不稳定蛋白。实时荧光定量PCR分析显示,AmMYB44基因在干旱和低温条件下的表达均明显上调,但调节幅度存在组织差异、条件差异和处理时间的差异。在AmMYB44启动子上发现了多个与逆境和激素应答相关的顺式作用元件。推测AmMYB44基因在黄芪干旱、低温等非生物胁迫应答中具有重要的调控作用,本研究将促进黄芪的抗旱抗寒分子机制的研究。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

橡胶树转录因子HbWRKY9的克隆与特性分析

通过RACE技术克隆得到一个新的橡胶树WRKY,命名为Hb WRKY9,Gen Bank登录号为JQ914653,基因全长为1 646 bp,ORF为954 bp,编码317个氨基酸。Hb WRKY9蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,与蓖麻(Ricinus communis)、麻疯树(Jatropha carcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)和酿酒葡萄(Vitis vinifera)的WRKY成员一致性分别为80%、79%、70%和63%。对其启动子序列的分析表明,启动子核心区域位于翻译起始密码子上游74~123 bp处,启动子序列中包含TATA-box、CAAT-box、5'UTR Py-rich stretch、WRKY转录因子结合位点W-box、MYB结合位点MBS,以及与光响应相关的调控元件G-box和Box4,分生组织特异表达调控元件CCGTCC-box,与缺氧诱导相关的ARE元件,与高温胁迫相关的调控元件HSE,与Me JA和ABA等激素响应相关的CGTCA-motif和ABRE等顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,Hb WRKY9基因能响应低温胁迫,呈上调表达。     

茶树CsLEA5基因的克隆及表达分析

该研究以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树胚胎发育晚期丰富蛋白基因CsLEA5的cDNA序列,该序列全长515 bp,包含一个375 bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,预测蛋白分子量为13.5 kD,理论等电点为5.92。蛋白序列分析结果显示,CsLEA5为高亲水性和稳定性蛋白,且含有一个典型的LEA_3保守结构域,属于LEA蛋白中LEA_3亚家族成员。CsLEA5基因启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如乙烯响应元件（ERE）、胁迫响应元件（STRE）、创伤响应元件（WUN motif）及MYB、MYC转录因子识别位点等。qRT PCR分析显示,CsLEA5基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的表达量最高,其次是嫩茎,而在其他组织器官中的表达量较低,且CsLEA5基因表达受低温和干旱胁迫的诱导。研究表明,CsLEA5基因可能在茶树响应低温和干旱胁迫过程中发挥重要作用。该研究对了解茶树抗逆分子机制,筛选抗性候选基因资源提供了重要理论依据。     

小麦非生物胁迫相关基因TaAIM的表达分析

MYB转录因子是一个在植物的应激反应中起着核心作用的蛋白质家族.为了进一步研究小麦非生物胁迫诱导转录因子的表达特性,利用同源克隆的方法从小麦中获得了 1个R2R3-MYB转录因子基因TaAIM,采用生物信息学方法对TaAIM的序列进行分析,采用半定量RT-PCR方法研究TaAIM在不同组织以及不同非生物逆境胁迫条件下的表达.序列分析表明,TaAIM的全长cDNA序列为1 509 bp,开放阅读框为960 bp,编码319个氨基酸,蛋白质预测分子量约为35.207 kD,等电点为4.8,预测其蛋白质二级结构包含12个α-螺旋.系统进化树分析表明,TaAIM与二穗短柄草中的1个R2R3-MYB转录因子有较高的相似性.序列多重比对表明,TaAIM与其同源蛋白序列的MYB结构域均高度保守.半定量RT-PCR分析表明,TaAIM在小麦各个组织中均表达,在根和叶中的表达量较为明显;在盐、PEG、ABA和低温处理后均能够诱导TaAIM表达.这些结果表明,TaAIM基因参与了小麦对非生物胁迫的响应,可为进一步研究TaAIM的生物学功能提供理论基础.     

非生物逆境胁迫下ZmCIPK10基因表达分析

干旱、高盐、低温、高温等非生物逆境严重影响植物的生长发育,研究参与逆境胁迫应答基因具有重要的理论意义和应用价值。从玉米中克隆了一个CIPK蛋白激酶基因,暂时命名为ZmCIPK10。该基因全长2 730 bp,转录长度2 100 bp,编码438个氨基酸。顺式元件分析发现在基因启动子区域存在ABRE、HSE、TC-rich repeats等推测的逆境顺势元件。荧光实时定量PCR结果表明ZmCIPK10在干旱、低温、盐胁迫下表达量上调,在ABA、高温胁迫下表达量下调。研究结果初步证实ZmCIPK10基因响应非生物逆境胁迫,为ZmCIPK10参与植物逆境信号途径及其功能研究提供理论依据。     

水稻胁迫相关基因OsPM1启动子的克隆与分析

依据NCBI数据库OsPM1的序列信息,采用PCR技术扩增获取OsPM1的2 100bp的启动子序列。利用PLACE预测启动子的顺式作用元件分析表明,启动子内含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,主要有ABA响应相关元件、脱水响应元件、低温响应元件、热激响应元件和转录因子结合元件。构建OsPM1的启动子和GUS基因融合表达载体,转入拟南芥。组织化学染色分析结果显示,非生物胁迫处理前,幼苗中GUS基因表达水平很低;干旱、低温、高盐等胁迫处理后,GUS基因表达量显著升高。研究表明,OsPM1的启动子能够显著提高在干旱、高盐和低温处理后下游基因的表达水平。     

资阳香橙砧木CjSPL基因家族鉴定及表达模式分析

鳞片启动子结合类蛋白(squamosa promoter binding protein-like,SPL)家族是一类参与调控植物生长发育以及响应环境胁迫的重要转录因子,但在柑橘等多年生果树中的研究较少。本研究以柑橘一种重要的砧木——资阳香橙(Citrus junos Sieb.ex Tanaka)为材料,基于plantTFDB转录因子数据库和甜橙基因组数据库鉴定并克隆出资阳香橙15个SPL家族基因,命名为CjSPL1–CjSPL15。序列分析表明,CjSPLs的开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为393–2865 bp,编码130–954个氨基酸;系统进化树将15个CjSPLs分为9个亚家族;基因结构和保守结构域分析预测出20个不同的保守motif和SBP基本结构域;启动子顺式作用元件分析预测出20种启动子元件,其中包含植物生长发育、非生物胁迫及次生代谢物相关元件。通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)分析了CjSPLs在干旱、盐和低温胁迫下的表达模式,较多CjSPLs在胁迫处理后显著上调表达。本研究为后续深入研究柑橘及其他果树SPL家族转录因子功能提供参考。     

大豆MYB转录因子基因GmMYB174的克隆及分子特性分析

克隆获得了大豆转录因子MYB基因GmMYB174,该基因序列全长1086 bp,编码361个氨基酸,属于MYB-related家族。生物信息学分析表明大豆GmMYB174与番茄、苜蓿、葡萄等物种同源性较高,序列分析表明包含2个保守的Trp(W)位点和1个保守基序SHAQKFF。亚细胞定位结果显示GmMYB174定位于细胞核中;组织表达量显示GmMYB174在多个组织均有表达,其中在上胚轴中表达量最高。启动子元件分析表明GmMYB174包含ABRE、MYB、MYC、LTRE、GT-1等逆境胁迫应答元件。实时荧光定量PCR分析表明Gm MYB174在干旱、盐、ABA处理下均有响应。因此,GmMYB174可能参与多种胁迫应答途径。     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

厚叶悬蒴苣苔BcWRKY1基因启动子克隆及功能元件分析

为了更好的了解BcWRKY1基因的表达调控方式,我们利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,从厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia)基因组中克隆了943bp的BcWRKY1基因的启动子序列。序列分析显示,该启动子中存在多种非生物胁迫反应元件,如MYC recognition site、MYB binding site、DRE\CRTCOREAT等。本研究有助于阐明WRKY家族基因在非生物胁迫下的作用机制。     

秋葵AeMYB1R1转录因子基因克隆及对胁迫的响应北大核心CSCD

MYB转录因子家族广泛参与了植物对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫的应答。为了深入研究秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]中的MYB类转录因子,该研究以‘北海道1号’秋葵为研究对象,采用PCR方法克隆AeMYB1R1基因,并借助生物信息学进行特征分析;采用qRT-PCR荧光定量方法分析其表达模式及其在非生物胁迫下的表达特性。结果表明:(1)成功克隆获得1个秋葵AeMYB1R1基因;该基因包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸;序列对比和系统进化树结果显示,AeMYB1R1在植物进化过程中具有较高的保守性;AeMYB1R1蛋白分子量为37 891.57 Da,等电点为8.75,含有较多的谷氨酸和较少的色氨酸,以及较多潜在的磷酸化位点和糖基化位点。(2)结构分析显示,AeMYB1R1蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲构成,无信号肽和跨膜结构,为疏水性蛋白;同时,氨基酸序列在第104至第156位含有一个保守结构域,表明其属于SHAQKYF类MYB家族转录因子。(3)qRT-PCR结果显示,AeMYB1R1基因在秋葵叶中的表达量最高,其次是根和茎,具有组织表达特性;与高温和低温胁迫相比,在盐胁迫和干旱胁迫中AeMYB1R1表达量更高,说明AeMYB1R1可能是秋葵抗盐和抗旱的关键转录因子。研究结果为AeMYB1R1基因在秋葵生长发育和抗逆机制中的功能研究奠定了理论依据。     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

霍山石斛DhGMDS基因克隆及低温胁迫下表达

基于霍山石斛转录组数据库,利用染色体步移技术,克隆霍山石斛GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因(DhGMDS)及其启动子,采用实时荧光定量PCR方法检测该基因的组织表达模式及低温处理下的表达,为进一步解析霍山石斛抗寒机制和遗传改良提供理论依据。结果表明：(1)成功克隆获得DhGMDS基因(GenBank登录号MW855573),其cDNA序列为1 134 bp, gDNA序列为1 523 bp,无内含子。(2)序列一致性分析显示,DhGMDS蛋白与黄花石斛(Dendrobium catenatum)的GMDS蛋白序列相似性达到99.03%;系统进化树分析表明,霍山石斛DhGMDS基因与黄花石斛GMDS基因处于同一进化节点上,二者亲缘关系近。(3)启动子序列分析发现,在DhGMDS基因上游启动子区含有光、低温、干旱和ABA响应元件,且具有MYB等转录因子识别和结合位点。(4)实时荧光定量PCR分析显示,DhGMDS基因在霍山石斛的花中表达量最高,其次为茎、叶,根中表达量最低;经4℃低温处理72 h后,DhGMDS基因受低温胁迫诱导上调表达,且在低温处理24 h的相对表达量最高,表明DhGMD...     

苦荞转录因子基因FtMYB21的克隆及其非生物胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物各种生理生化过程。本研究根据苦荞花期转录组数据,筛选得到一条与拟南芥At MYB1同源性高的序列,采用RT-PCR技术克隆得到该基因,命名为Ft MYB21。生物信息分析表明,该基因编码蛋白含364个氨基酸,相对理论分子量40.0 k D,理论等电点p I 5.79。多重序列比对表明,其编码蛋白属于典型的R2R3型MYB转录因子。进化树分析表明,Ft MYB21蛋白与拟南芥参与抗逆的At MYB1聚为一簇。荧光定量PCR分析表明,Ft MYB21在高盐胁迫下表达量持续显著上升,72 h时达最大值,为对照组的3.35倍;在PEG干旱胁迫下该基因表达量迅速上调,6 h后趋于稳定,为对照组的1.8倍。因此,Ft MYB21基因可能参与苦荞抗高盐和干旱等非生物胁迫的应答反应,这为进一步理解苦荞的抗逆生理奠定了基础。