香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

中间锦鸡儿CiABR17基因的克隆及表达分析

该研究采用blastn比对方法,从中间锦鸡儿干旱胁迫抑制消减杂交文库筛选出ABA响应蛋白17基因(ABR17)的EST序列。RACE扩增得到cDNA序列594bp,其中ORF为471bp,编码157个氨基酸,预测蛋白质分子量为16.44kD,等电点为4.93,平均疏水指数为-0.126,是一种亲水蛋白。实时荧光定量PCR检测发现,中间锦鸡儿CiABR17基因在脱水、NaCl和热胁迫下均有不同程度表达,说明CiABR17基因与中间锦鸡儿响应逆境胁迫有关;过表达CiABR17拟南芥株系的鲜重、干重和莲座直径均极显著高于野生型株系。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

青杄PwNAC42基因的克隆及表达模式分析

NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,广泛参与了植物的生长发育过程,并在植物响应盐害、干旱、冷害和脱落酸等多种非生物胁迫的过程中发挥重要作用。通过青杄转录组数据获得PwNAC42基因的cDNA序列,对其蛋白序列进行生物信息学预测,通过实时荧光定量PCR检测PwNAC42基因在青杄各个组织及非生物逆境胁迫下的表达水平。生物信息学分析结果显示:PwNAC42基因cDNA全长共1 749 bp,其中编码区1 140 bp,共编码379个氨基酸;蛋白理论分子质量为42.92 k D,理论等电点为6.53,有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点,不存在信号肽结构域,为非跨膜的亲水蛋白。组织特异性表达结果显示,PwNAC42在青杄球果中表达量最高。逆境胁迫实验表明PwNAC42的表达量在NaCl、干旱、4℃以及脱落酸处理下产生显著的变化。因此推测PwNAC42在青杄球果发育及青杄对逆境胁迫的响应过程中发挥作用。     

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白（pathogenesis related protein, PR） 10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）编码PR10的EST（expressed sequence tag）序列设计引物,利用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长cDNA序列,并命名为JsPR10-1。JsPR10-1全长cDNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5′-非编码区以及219 bp 3′-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。JsPR10-1编码的蛋白质与栎树（Quercus suber）、欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）以及欧洲板栗（Castanea sativa）的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导JsPR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）后,JsPR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明JsPR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表达特征

采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增法和长片段PCR技术,从杜梨幼苗中获得1个磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（Pb—PEAMT）,运用生物信息学方法分析它的序列特点,并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达情况。结果表明：PbPEA臌因编码区DNA序列长为3320bp,由11个外显子和10个内含子组成,cDNA序列长1479bp,推导的多肽包括2个II型甲基转移酶保守结构域,与蓖麻PEAMT蛋白相似性最高（86％）,亲缘关系最近。PbPEA燃因在杜梨幼苗根和叶中均为诱导型表达,100mmol·L^-1氯化钠、10％（w／v）聚乙二醇、180mmol·L^-1甘露醇或20μmol·L^-1脱落酸处理后PbPEAMT表达水平上升,表明PbPEAMT对盐碱、干旱和渗透胁迫存在表达响应,可能参与ABA介导的逆境信号转导途径。     

丹参中硫堇基因SmTHI的克隆和表达分析

丹参EST序列的Blast分析表明,一条序列与硫堇（thionin,THI）基因有较高的同源性,该序列长575bp,包含1个长366bp的开放阅读框（ORF）,编码121个氨基酸,命名为SmTHI,GenBank登陆号为DQ212984。在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平上克隆到该基因的全编码区序列的结果表明,该基因无内含子。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物的THI蛋白前体高度同源,并符合植物硫堇类蛋白的序列模式和特征：C—C—x（5）．R．x（2）-[FY]-x（2）-C,N端具17个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的58个氨基酸为酸性多肽部分。成熟的THI蛋白带正电荷,偏碱性,推测可能有抗病原微生物活性。实时定量PCR检测SmTHI在丹参不同组织部位的表达以及在黄瓜细菌性角斑病菌（PSL）、NaCl和水杨酸（sA）溶液诱导下的表达结果表明：SmTHI在植物的根、茎和叶中均有不同程度的表达,其表达丰度为叶〉茎〉根：在PSL、NaCl和sA溶液诱导下该基因的表达呈上调趋势。     

番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析

NAC转录因子在调控植物生长发育、生物及非生物逆境应答中发挥着重要作用。前期,我们通过对番茄幼苗在低温胁迫下的基因表达谱进行分析,发现Unigene SGN-U212711受低温诱导表达强烈。本研究从番茄中克隆了该基因,命名为Sl NAC41,其开放阅读框（ORF）1 173 bp,编码390个氨基酸,蛋白N端具有典型的NAM结构域,属于NAC转录因子家族成员。预测Sl NAC41蛋白分子量为43.5 k Da,等电点为5.2。实时荧光定量PCR分析表明,Sl NAC41在番茄各组织均有表达,在花中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。低温、干旱、高盐、甲基紫精（MV）、脱落酸（ABA）及乙烯利（ETH）处理均能诱导该基因的表达,其中,以低温和干旱诱导表达最为强烈。利用PLACE和Plant CARE对启动子序列进行预测分析发现,Sl NAC41启动子区含有大量响应光、病原菌侵染、激素、低温、脱水及盐胁迫的顺式作用元件。这些结果表明,Sl NAC41可能在番茄生物及非生物胁迫应答中发挥重要调控作用。     

中间锦鸡儿转录因子基因 CiNAC1的克隆及功能分析

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,在植物应答非生物胁迫和生长发育过程中有重要的功能。该研究通过PCR技术,克隆得到了中间锦鸡儿 CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全长序列。生物信息学分析显示, CiNAC1基因的开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸,推导的蛋白分子量为34.57 kD,等电点为8.35,是一种亲水性蛋白,N端具有保守的NAM结构域,具有26个磷酸化位点和7个糖基化位点。实时荧光定量PCR检测显示,中间锦鸡儿 CiNAC1基因表达受干旱、高盐、脱水、高pH诱导;亚细胞定位发现CiNAC1定位到细胞核中,这与它作为转录因子的功能是一致的;转CiNAC1基因拟南芥株系侧根数目显著多于野生型,根长也明显比野生型长。研究认为, CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。     

小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶（JcGPAT）cDNA的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶是植物生物合成储存油脂过程中的关键酶,对油料作物种子含油量具有重要的限制作用。本研究以植物甘油-3-磷酸酰基转移酶同源基因的保守区域序列为基础,设计简并引物,结合RACE技术,从能源植物小桐子种子中克隆获得JcGPAT基因的cDNA全长序列（GenBank登录号HQ395225）。JcGPAT cDNA核苷酸序列长度为1672bp,开放阅读框为1125bp,编码375个氨基酸。该基因具有明显的GPAT基因结构域,其编码的氨基酸序列与油桐、蓖麻等植物具有很高的同源性。RT-PCR表达分析表明,该基因在小桐子发育的种子、叶、根尖等多个组织表达。     

小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析

依赖于DNA甲基化的基因表达调控在植物生长发育过程中发挥重要功能,而DNA甲基转移酶是调节DNA甲基化模式的功能蛋白之一。本研究采用RACE技术克隆了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的包含完整编码区的cDNA序列,并系统分析了该基因的结构特征及其在小麦生长发育过程中的表达特性。结果表明,TaDnMT2的cDNA序列为1321bp（GenBank登录号：JN642641）,其中5′-和3′-UTR（非翻译区）分别为84和115bp、ORF（开放阅读框）1122bp;TaDnMT2编码的氨基酸序列包含2个S-腺苷甲硫氨酸结合域（I和X）、甲基转移酶活性位点（IV）、靶胞嘧啶结合位点（VI）、中和DNA骨架负电荷域（VIII）和靶位点识别区（IX）6个高度保守域,属于DNA甲基转移酶家族的DnMT2亚类;三维结构预测显示,TaDnMT2蛋白可以形成包括7个β-折叠和4个α-螺旋的特定空间结构。表达特性分析的结果表明,TaDnMT2基因在‘京841’小麦不同发育时期的叶中表达量均较高,且其在三叶龄期和五叶龄期的表达量受春化处理的影响;在种子发育过程中,该基因在授粉后5d的种子中表达量较高,随着种子发育进程的推进其表达水平呈逐渐下降趋势;在不同发育时期的根系中,TaDnMT2基因均具有较高水平的表达,且在分蘖期根系中的表达量最高。推断TaDnMT2基因可能在小麦生长发育过程中发挥重要功能。     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

水稻MYB转录因子OsDUO1的cDNA克隆及其表达模式初步分析

我们利用RT-PCR方法成功从水稻中克隆了R2R3类MYB转录因子OsDUO1（Oryza sativa duo pollen1）的全长为1032bp的cDNA,该基因编码一个343个氨基酸残基的蛋白。RT-PCR分析结果表明OsDUO1只在水稻的花粉发育后期表达,说明OsDUO1可能对水稻花粉发育具有生物学功能。生物信息学分析表明,OsDUO1在短柄草、高粱、玉米、拟南芥、烟草、葡萄、蓖麻、杨毛果、小立碗藓植物中有相近同源序列,暗示该基因在进化中具有保守的生物学功能。     

小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析

用cDNA-AFLP技术从小黑杨中克隆与盐胁迫反应相关的cDNA片段,进一步应用RACE技术克隆出具有完整开放读码框的小黑杨环锌指蛋白基因（PsnRZF）,该基因全长1061bp,其中5非翻译区为184bp,3非翻译区为82bp,开放读码框为795bp,编码264个氨基酸,预测蛋白的分子量为30.25kDa,理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示,正常生长条件下该基因在根、茎、叶中都表达;NaCl胁迫下,该基因在根、茎、叶中的表达量升高。在叶中的表达量随着处理时间的延长而逐渐升高,胁迫处理后第6天表达量达到最高。     

四翅滨藜AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析

脱水素（dehydrin,DHN）是一类胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）,在植物脱水条件下能保护细胞内蛋白质和膜结构免受破坏。本研究中,从四翅滨藜（Atriplex canescens）cDNA文库克隆得到逆境胁迫相关蛋白基因AcDHN的全长cDNA（登录号：JN974246）,并进行序列分析。将4cD鼢别插入到原核表达载体pET28a和双元表达载体pYES-DEST52中,通过转化大肠杆菌和酿酒酵母进行原核表达分析和真核表达分析。结果表明：AcDHN序列全长为1408bp,完整的开放阅读框长为1017bp,由338个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子量为38.3kDa,理论等电点为6．47,AcDHN与仙人掌中DHN蛋白同源性为55％。AcDHN基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约45．2kDa的融合蛋白。重组酵母菌株能表现出艮好抗逆性,特别是对NaCl、低温、Na2CO3和NaHCO3胁迫的抗逆性,其中抗碱胁迫能力表现最强。