不对称还原苯乙酮的酵母菌株筛选与分子鉴定

利用苯乙酮作为模式底物,对145株菌株进行初筛和复筛,获得一株具有高效立体选择性的酵母菌株YS6-2,能够不对称还原苯乙酮生成(S)-1-苯基乙醇.在苯乙酮浓度为70mmol/L时,底物的初始转化率达26.8%,产物(S)-1-苯基乙醇的对映体过量值为98.8%.基于形态学、生理生化特征、18S rDNA和26S rDNA D1/D2区域的分析表明,YS6-2为胶红酵母(Rhodotorula muci-laginosa).     

酿酒酵母B5不对称还原制备手性药物中间体R-2′-氯-1-苯乙醇的研究

从11株微生物中筛选出4株具有不对称还原2′-氯-苯乙酮能力的酵母,其中酿酒酵母B5的还原产率与对映体选择性最佳。确定了酿酒酵母B5对2′-氯-苯乙酮还原的最佳反应时间为24h;最佳pH 8.0;最佳反应温度为25℃;最佳共底物为5%（体积比）乙醇。同时研究了底物浓度、微生物的量、微生物的培养条件等对反应产率和立体选择性的影响。细胞浓度为10.75mg/mL（细胞干重/反应体积）的酿酒酵母B5可将647mmol/L的2′-氯-苯乙酮100%地转化为R-2′-氯-1-苯乙醇,其对映体选择性为100%。酿酒酵母B5可重复利用的特点可提高产物的产量。     

牛瘤胃分离菌株静息细胞培养体系生物转化黄豆苷原

从牛瘤胃胃液中分离了一株在厌氧条件下能利用其生长细胞将大豆异黄酮黄豆苷原高效还原为二氢黄豆苷原的革兰氏阳性细菌菌株Niu-O16。研究了菌株Niu-O16静息细胞体系转化黄豆苷原的最佳转化条件,通过单因素试验确定菌株Niu-O16静息细胞转化黄豆苷原的最佳条件是:初始pH6.0～8.0,静息细胞浓度32～64mg/mL(湿重),加入底物浓度0.8～1.2mmol/L。通过正交试验确定了静息细胞浓度、加入底物浓度及转化时间的最佳组合为:静息细胞浓度32mg/mL、加入底物浓度0.8mmol/L、转化时间24h;最佳转化条件下底物转化率最高为63.9%。该结果为厌氧菌的静息细胞转化及工业应用提供了参考。     

酿酒酵母B5不对称还原制备手性药物中间体R-2′-氯-1-苯乙醇的研究

从 11株微生物中筛选出 4株具有不对称还原 2′ 氯 苯乙酮能力的酵母 ,其中酿酒酵母B5的还原产率与对映体选择性最佳。确定了酿酒酵母B5对 2′ 氯 苯乙酮还原的最佳反应时间为 2 4h ;最佳pH 8 0 ;最佳反应温度为2 5℃ ;最佳共底物为 5 % (体积比 )乙醇。同时研究了底物浓度、微生物的量、微生物的培养条件等对反应产率和立体选择性的影响。细胞浓度为 10 75mg mL(细胞干重 反应体积 )的酿酒酵母B5可将 6 47mmol L的 2′ 氯 苯乙酮10 0 %地转化为R 2′ 氯 1 苯乙醇 ,其对映体选择性为 10 0 %。酿酒酵母B5可重复利用的特点可提高产物的产量。     

疏水离子液体中生物不对称还原制备手性醇

针对近平滑假丝酵母全细胞不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学纯(R)-苯基乙二醇反应中底物的质量浓度、产量及质量平衡低的问题,运用多相萃取生物转化的原理,比较不同非水介质对不对称还原反应效率的影响,构建具有良好生物相容性和高质量平衡的水/疏水离子液体1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐([BEIM]PF6)双相反应体系。考察该体系下辅助底物种类、辅助底物用量、底物质量浓度、催化剂用量、离子液体比例、p H和反应温度对生物催化反应的影响,通过正交试验设计和响应面法优化不对称还原2-羟基苯乙酮的反应条件,在最优反应条件下,产物质量浓度、产率和质量平衡得率分别达到15.35 g/L、76.8%和84.3%,产物的对映消旋值(e.e.值)大于99.9%。     

不对称还原2-辛酮的菌株筛选和反应条件的研究

从本实验室保藏菌株中筛选出一株酒明串珠菌Oenococcus oeni CECT 4730,能不对称还原2-辛酮得到R-2-辛醇。对反应条件的研究表明：Tris-硼酸（TBE）是最佳缓冲液,葡萄糖是最佳辅助底物,壬烷是最佳有机相,当采用300 mmol/L的TBE缓冲液、300 mmol/L的葡萄糖、1：1（体积比）的两相比、150 g/L的湿菌体质量浓度下,可以实现3%的2-辛酮转化为R-2-辛醇（转化率〉99%）,并且e.e.值为97%。     

Bacillus megaterium WZ009催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯

以外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一C源的富集培养筛选得到一株菌株WZ009,经16S rDNA测序鉴定为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。B.megaterium WZ009静息细胞可以立体选择性催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.≥99%)和(S)-3-羟基-γ-丁内酯(e.e.≥95%)。笔者对B.megaterium WZ009不对称催化反应影响因素(温度、pH、中和剂、底物浓度、时间进程以及细胞重复利用)进行优化研究,确定了该反应体系最优条件:底物浓度200 mmol/L,中和剂氨水,pH 7.2,40℃反应12 h,转化率达到50.6%,底物对映体过量值为99.6%。该生物催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。     

不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选及反应特性

含芳香基手性醇是许多手性药物合成的关键手性砌块,生物催化不对称还原前手性酮是合成该类醇的重要方法之一.以4'-氯-苯乙酮为模型底物,从土壤中筛选得到一株能高效催化前手性芳香酮不对称还原合成相应手性醇的菌株,鉴定表明该菌株为白地霉( Geotrichum candid ).进一步考察了其催化4'-氯-苯乙酮不对称还原的反应特性,发现还原4'-氯-苯乙酮的产物主要为 S-4'-氯苯乙醇.在合适的反应条件下,其产率达到35%,对映选择性高于97%.     

羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇

从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。     

苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌构建

【背景】(S)-a-苯乙醇是一种重要的药物合成中间体,利用工程菌将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的方法具有立体选择性强、转化条件温和等优势,该研究对未来绿色工业化生产有重要意义。【目的】构建能将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌并对其转化条件进行研究。【方法】分别从红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)中克隆得到羰基还原酶基因ReADH以及甲酸脱氢酶基因FDH,构建pRSFDuet-ReADH-FDH(R1F2)和pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2)两个共表达载体,分别在大肠杆菌中表达。测定R1F2和F1R2中ReADH和FDH酶活性及其催化反应的最适反应条件。对利用全细胞转化苯乙酮为(S)-a-苯乙醇反应条件进行研究。【结果】构建了R1F2和F1R2两个共表达载体,其中R1F2中ReADH和FDH的酶活性分别为6.7 U/mL和7.6 U/mL,对苯乙酮有更强的催化还原能力。R1F2中ReADH和FDH的最适pH分别为6.0和8.5,最适温度分别为40°C和35°C。R1F2全细胞转化苯乙酮反应的最适pH和温度分别为7.5和30°C,对高底物有较强耐受性,对400 mmol/L苯乙酮转化率大于98%,产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度大于99%。【结论】研究获得的工程菌及其全细胞转化条件为工业应用奠定了基础。