牛心线粒体ATP酶抑制蛋白对酶的催化部位构象的影响

以标记在ＡＴＰ酶（Ｆ１）催化部位的ＴＮＰ－ＡＴＰ为荧光探针,比较测定了Ｆ１与其抑制蛋白（ＩＦ１）结合前后的ＴＮＰ－ＡＴＰ荧光光谱,荧光寿命和荧光偏振光谱,结果表明在ＩＦ１的作用下,酶分子催化部位的极性下降,ＴＮＰ－ＡＴＰ分子的自由度减小,提示ＩＦ１引起了Ｆ１催化部位的构象改变。     

Mg~（2＋）对线粒体H~＋－ATP酶的阿霉素敏感性的拮抗效应──H~＋－AT

用生物膜的拆离与重建技术,研究了Ｍｇ２＋对阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ,ＡＤＭ）抑制猪心线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶及其重建脂酶体（Ｌ·Ｈ＋－ＡＴＰ酶）活性的影响。用胆酸盐透析方法将Ｈ＋－ＡＴＰ酶在大豆磷脂脂质体上重建。实验结果表明,重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶的ＡＤＭ的敏感性较仅纯化而未重建者明显增加,这提示ＡＤＭ的抑制作用依赖于磷脂。但是,在有Ｍｇ２＋（１ｍｍｏｌ／Ｌ）条件下重建的Ｈ＋－ＡＴＰ酶对ＡＤＭ的敏感性较无Ｍｇ２＋者却又显著降低,这提示Ｍｇ２＋对ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用具有拮抗效应。Ｍｇ２＋的这种拮抗效应是与其在透析重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶过程中诱导脂酶体的磷脂的物理状态的改变相关的。所得实验结果对于阐明ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用机理与磷脂的相关性提供了较直接的实验证据。     

Mg~（2＋）对线粒体H~＋－ATP酶的阿霉素敏感性的拮抗效应──H~＋－AT

用生物膜的拆离与重建技术,研究了Ｍｇ２＋对阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ,ＡＤＭ）抑制猪心线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶及其重建脂酶体（Ｌ·Ｈ＋－ＡＴＰ酶）活性的影响。用胆酸盐透析方法将Ｈ＋－ＡＴＰ酶在大豆磷脂脂质体上重建。实验结果表明,重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶的ＡＤＭ的敏感性较仅纯化而未重建者明显增加,这提示ＡＤＭ的抑制作用依赖于磷脂。但是,在有Ｍｇ２＋（１ｍｍｏｌ／Ｌ）条件下重建的Ｈ＋－ＡＴＰ酶对ＡＤＭ的敏感性较无Ｍｇ２＋者却又显著降低,这提示Ｍｇ２＋对ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用具有拮抗效应。Ｍｇ２＋的这种拮抗效应是与其在透析重建Ｈ＋－ＡＴＰ酶过程中诱导脂酶体的磷脂的物理状态的改变相关的。所得实验结果对于阐明ＡＤＭ抑制线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶的作用机理与磷脂的相关性提供了较直接的实验证据。     

Mg~（2＋）促进线粒体H~＋－ATP酶的重建机理──H~＋－ATP酶复合体亚基水平的研究

用专一性标记蛋白质巯基（－ＳＨ）的荧光探剂ａｃｒｙｌｏｄａｎ测定含Ｍｇ２＋的Ｆ０－ＡＴＰ酶或Ｆ０－ＯＳＣＰ－Ｆ１－ＡＴＰ酶的脂酶体的构象与无Ｍｇ２＋者明显不同,前者的蛋白质的－ＳＨ基团处于疏水性更强的微环境中;在有Ｍｇ２＋和ＯＳＣＰ同时存在下重建的Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶脂酶体较无ＯＳＣＰ者表现更高的水解活力或膜电位,表明ＯＳＣＰ增强Ｍｇ２＋的促进作用,这进一步提示Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态促进线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶重建的间接作用。这些实验结果,从线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的亚基水平的相关性上,对于我们提出的Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态使之具有合适的流动性,诱导嵌入脂双层的Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的Ｆ０的构象发生变化并传递至复合体的催化中心Ｆ１,从而使重建Ｆ１－Ｆ０－ＡＴＰ酶具有较适合的蛋白构象,表现较高的重建酶活性的假设提供了直接的实验证据,精确地阐明了Ｍｇ２＋促进线粒体Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶重建作用的分子机理。     

牛心线粒体ATP酶抑制蛋白对酶的催化部位构象的影响

以标记在ＡＴＰ酶（Ｆ_１）催化部位的ＴＮＰ－ＡＴＰ为荧光探针,比较测定了Ｆ_１与其抑制蛋白（ＩＦ_１）结合前后的ＴＮＰ－ＡＴＰ荧光光谱、荧光寿命和荧光偏振光谱。结果表明在ＩＦ１的作用下,酶分子催化部位的极性下降,ＴＮＰ－ＡＴＰ分子运动的自由度减小,提示ＩＦ_１引起了Ｆ_１催化部位的构象改变。     

两价阳离子在类囊体膜上H~＋－ATP酶活化中的作用

在高盐介质中用ＥＤＴＡ去除叶绿体内源游离Ｍｇ２＋后制备的类囊体具有与正常类囊体相似的△ｐＨ幅度和光合磷酸化反应速率,即膜上ＣＦ０与ＣＦ１仍处于正常的耦联状态。以此为材料研究不同两价阳离子（Ｍ２＋）在ＡＴＰ酶活化及催化反应中的作用,结果表明：（１）Ｍｇ２＋Ｃａ２＋Ｍ２＋Ｚｎ２＋Ｃｏ２＋Ｂａ２＋分别对光下ＡＴｈ形成与水解的效应大小与它们的离子半径有一定关系。（２）这些Ｍ２＋以不同方式不同程度地抑制了Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的合成或水解ＡＴＰ的活性。（３）低浓度Ｍ２＋的电荷屏蔽效应可稳定酶在光下的活化构象,这有利于暗中进行的需Ｍｇ２＋的催化ＡＴＰ合成与水解反应。     

H~＋－ATPase单位点水解过程中Fo构象的变化

利用Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体（也称ＡＴＰ合成酶）中的Ｆｏ的色氨酸荧光,观察了复合体中Ｆ１结合ＡＴＰ或ＡＤＰ（酶蛋白与底物分子比为１：１）时,Ｆｏ的荧光猝灭常数的变化（用竹红菌乙作为膜区蛋白荧光的猝灭剂）结果表明Ｆ１结合ＡＴＰ或ＡＤＰ时Ｆｏ可得到不同的猝灭常数（Ｋｓｖ）,也就是Ｆｏ会产生不同的构象变化。加入二价金属离子起动ＡＴＰ水解反应结束后：ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ→ＡＤＰ＋Ｐｉ,这时可以在Ｆｏ观察到与ＡＤＰ加Ｍｇ２＋时相同猝灭常数Ｋｓｖ;用荧光强度随时间进程变化的实验可观察到Ｆ１水解过程中导致Ｆｏ构象变化的动力学过程。这些结果说明了Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体ＡＴＰ合成的过程中Ｆ１与Ｆｏ之间存在着构象之间的通信与传递。     

铝和铝＋钙对小麦幼苗根尖质膜,液泡膜微囊ATP酶和膜流动性？…

研究了铝和铝＋＿钙对小麦功苗根尖质膜、液泡膜微囊Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶、Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶、Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶活性及共动力学参数和膜流动性的影响。在质膜和液泡膜微囊制剂中加入１．０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＩ＾３＋（ＡＩＣＩ３）时,Ｈ＾２＋－ＡＴＰ囊制剂中加入１．０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＩ＾３＋（ＡＩＣＩ３）时,Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶、Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶、Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶活笥和酶促反应的Ｖｍａｘ及膜流动性下降,而酶     

Mg~（2＋）促进线粒体H~＋－ATP酶的重建机理──H~＋－ATP酶复合体亚基水平的研究

用专一性标记蛋白质巯基的荧光探剂ａｃｒｙｌｏｄａｎ测定含Ｍｇ＾２＋的Ｆ０－ＡＴＰ酶或Ｆ０－ＯＳＣＰ－Ｆ１－ＡＴＰ酶的脂酶体的构象与无Ｍｇ＾２＋者明显不同,前者的蛋白质的－ＳＨ基团处于疏水性更强的微环境中;在有Ｍｇ＾２＋和ＯＳＣＰ同时存在下重建的Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶脂酶体较无ＯＳＣＰ者表现更高的水解活力或膜电位,表明ＯＳＣＰ增强Ｍｇ＾２＋的促进作用,这进一步提示Ｍｇ＾２＋通过改变膜脂的物理状态促进线     

平滑肌肌球蛋白磷酸化与肌动球蛋白功能调节

在有Ｃａ＾２＋和钙调蛋白存在时,肌球蛋白轻链激酶催化肌球蛋白磷酸化,促使肌动蛋白激活的肌球蛋白（肌动球蛋白）Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶活性显增加,然而,肌旧白磷酸水平化与Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶活性显增加,然而,肌球蛋白磷酸化水平与Ｍｇ＾２＋＝ＡＴＰ酶之间的关系是非线性的,原肌球蛋白可以进一步增加Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶的活性,但仍不改变它们之间的非线性关系,肌球蛋白边激酶的分成肽抑制剂抑制了肌球蛋白磷酸化     

颈髓损伤后线粒体系列酶活性变化与线粒体功能的关系

为了探讨颈髓损伤后颈髓线粒体系列酶活性变化与线粒体功能的关系,采用Ａｌｅｎ法造成猫颈髓损伤,观察颈髓损伤后线粒体Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶、Ｎａ＋,Ｋ＋－ＡＴＰ酶、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性及线粒体呼吸功能的变化。结果显示：颈髓损伤后２ｈ至７２ｈ,Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶、Ｎａ＋,Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性、ＳＯＤ活性明显降低,而线粒体呼吸控制率（ＲＣＲ）、磷氧比值（Ｐ／Ｏ）、氧化磷酸化效率（ＯＰＲ）也明显下降。表明颈髓损伤后Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶、Ｎａ＋,Ｋ＋－ＡＴＰ酶、ＳＯＤ活性与线粒体功能密切相关,提示颈髓线粒体的病理生理改变在颈髓损伤后继发性损害过程中起重要作用。     

平滑肌肌球蛋白磷酸化与肌动球蛋白功能调节

在有Ｃａ２＋和钙调蛋白存在时,肌球蛋白轻链激酶催化肌球蛋白磷酸化,促使肌动蛋白激活的肌球蛋白（肌动球蛋白）Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性显著增加．然而,肌球蛋白磷酸化水平与Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶之间的关系是非线性的,原肌球蛋白可以进一步增加Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的活性,但仍不改变它们之间的非线性关系．肌球蛋白轻链激酶的合成肽抑制剂抑制了肌球蛋白磷酸化和Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性,并导致平滑肌去膜肌纤维的等长收缩张力与速度的降低．结果提示肌球蛋白轻链激酶参与脊椎动物平滑肌收缩的调节过程,肌球蛋白轻链磷酸化作用会引起平滑肌收缩     

钆和镱对人红细胞膜脂及膜蛋白的作用

利用荧光偏振,自旋标标顺磁共振波谱和激光拉曼技术研究了钆和镱对人红细胞膜结构和功能的影响。结果表明,低浓度的Ｇｄ３＋（０．５μｍｏｌ／Ｌ）对（Ｎａ＋＋Ｋ＋）－ＡＴＰ酶和Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶有轻微的激活作用,而随着其浓度的增大,则明显抑制酶的活性,Ｇｄ３＋与Ｙｂ３＋和人红细胞膜作用后,降低膜脂流动性,并使膜蛋白酰胺Ｉ＇－α螺旋振动强度减弱．     

鼠脑突触体Mg^2＋—ATP酶质子泵活性的研究

位于突触体质膜的外向型（ｅｃｔｏ）Ｍｇ＾２－ＡＴＰ酶具有水解ＡＴＰ活性,能量偶联的ＡＣ－ＭＡ荧光淬灭实验表明Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶水解ＡＴＰ时向膜内转移质子,建立跨膜质子梯度,跨膜质子梯度可以被电中性Ｋ＾＋／Ｈ＾＋离子载体Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ消除,利用Ｈ＾＋敏感的ＢＣＥＣＦ荧光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表明水解ＡＴＰ产生的质子转移突触体ｐＨｉ下降了光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表示水解ＡＴＰ产生     

蚕豆和玉米叶绿体atpE基因表达产物的生物活性差异 …

编码蚕豆和玉米叶绿体ＡＴＰ合酶ε亚基的ａｔｐＥ基因分别在大肠杆菌中获得了高效表达,两种表达的ε亚基蛋白在抑制ＣＦ１－ＡＴＰ酶水解ＡＴＰ、阻塞类囊体膜质子通道以及它促进光合磷酸化等方面均明显地强于蚕豆的ε亚基蛋白。该结果表明：（１）ε亚基对ＡＴＰ合酶活性的调节作用与基同ＡＴＰ合酶其他亚基间的亲和力大小密切相关;（２）ε亚基抑制ＣＦ１水解ＡＴＰ和阻塞质子通道两个功能是呈正相关的。圆二色性（ｃｉｒｃｕｌ     

H~＋－ATPase单位点水解过程中Fo构象的变化

利用Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶复合中的Ｆｏ的色氨酸荧光,观察了复合体中Ｆ１结合ＡＴＰ或ＡＤＰ时,Ｆｏ的荧光猝灭常数的变化结果表明Ｆ１结合ＡＴＰ或ＡＤＰ时Ｆｏ可得到不同的猝来常数,也就是Ｆｏ会产生不同的构象变化。这些结果说明了Ｈ＾＋ＡＴＰ酶合ＡＴＰ合成的过程中Ｆ１与Ｆｏ之间存在着构象之间的通信与传递。     

蛋白激酶抑制剂噬菌体的构建和功能研究

人工合成编码ｃＡＭＰ信赖蛋白激酶（ｃＡＰＫ）的热稳定抑制剂第５－２４位氨基酸「ＰＫＩ（５－２４）」的ＤＮＡ片段,并将之克隆到ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ载体ｆｄ－ｔｅｔ－ＤＯＧ１使中,使ＰＫＩ（５－２４）以融合于ｇ３ｐ蛋白的形式展示了噬菌体是到了ＰＫＩ噬菌体,蛋白激酶抑制活性测定表达ＰＫＩ噬菌体可有铲地抑制ＣＡＰＫ的活性。结合实验结果显示ＰＫＩ噬菌体能与固相化小鼠ＣＡＰＫ催化亚基α（Ｈｉｓ６－ｍＣα     

N_2和NH_4~＋培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白圆二色谱及热力学特性比较

Ｎ２和ＮＨ培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白（分别为Ａｆ２和Ａｆ＊２）的氧化态和还原态的ＣＤ谱及ＭＣＤ谱存在明显差异。还原态Ａｆ２与Ａｆ＊２在２１０ｎｍ附近的ＭＣＤ谱完全不同,但它们的氧化态ＭＣＤ谱相同。热力学测定结果表明．在２９８°Ｋ,１．０１３×１０５Ｐａ下,Ａｆ２与ＭｇＡＴＰ饱合络合时的培（△Ｈ°）变化为－２７．０ｋＪ／ｍｏｌ,自由能（△Ｇ°）变化则为－２０．８ｋＪ／ｍｏｌ．熵（△Ｓ°）变４也为－２０．６Ｊｍｏｌ－１Ｋ－１。而Ａｆ＊２与ＭｇＡＴＰ饱合络合时的烂变化为－４４．３５ｋＪ／ｍｏｌ,自由能变化为一２０．４ｋＪ／ｍｏｌ,熵变化为－７９．９Ｊｍｏｌ－１Ｋ－１。Ａｆ２与ＭｇＡＴＰ络合后再与Ｎ２培养的钼铁蛋白反应为吸热反应,而Ａｆ＊２与ＭｇＡＴＰ络合后再与ＮＨ培养的钼铁蛋白反应为放热反应。     

CaMBP—10介导的质膜H^＋—ATP酶磷酸化对该酶活性的调节

ＣａＭＢＰ－１０在活体处理条件下,抑制ＩＡＡ诱导的质膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶活性及其磷酸化,抑制作用可被ＩＡＡ逆转并在外加ＣａＭ时被消除,与前期ＢＰ－１０对ＩＡＡ生理应答的调节效应相吻合。并且在各项处理中,质膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶活性与其磷酸化水平呈现极显著的正相关。     

高等植物Rubisco的组装及其中间产物的鉴定

将新鲜制备的不含Ｒｕｂｉｓｃｏ的水稻叶片低分子量蛋白组分在离体条件下于室温保温４８ｈ,ＮＤ－ＰＡＧＥ分析发现在ＡＴＰ ５ｍｍｏｌ／Ｌ和Ｍｇ＾２＋ ５ｍｍｏｌ／Ｌ的作用条件下,在分子量为５６０ｋＤ位置上有一蛋白带生成。高浓度的Ｋ拓一定程度上抑制它的形成,在保温介质中没有ＡＴＰ存在时,不能产生５６０ｋＤ分子量的条带,但有一更高分子量（约６００ｋＤ）蛋白条带的产生,这一条带能在ＡＴＰ和Ｍｇ＾２＋作用下发