miR-205调控HMGB1减轻LPS诱导的小鼠急性肾损伤

目的探讨miR-205对脓毒症小鼠急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的影响及可能的作用机制。方法 40只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组(control)、模型组(LPS)、阴性对照组(LPS+miR-scramble)、干预组(LPS+miR-205 mimics),每组10只。造模后24h取小鼠全血测定血肌酐(serum creatinine, SCr)和尿素氮(urea nitrogen,BUN)水平,造模后5d处死小鼠取肾组织,苏木素-伊红(HE)染色评估肾脏组织病理损伤,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肾组织中miR-205的表达,Western blot检测肾组织中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肾组织中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等炎性相关因子水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-205对HMGB1的靶向调控关系。结果与空白对照组比较,LPS处理组小鼠血清SCr和BUN水平均升高,肾脏组织病理损伤评分升高,miR-205表达降低,HMGB1蛋白表达升高,IL-1β、TNF-α、IL-6水平均升高;与LPS处理组和阴性对照组比较,干预组小鼠血清SCr和BUN水平均明显降低,肾脏组织病理损伤评分下降,miR-205表达升高,HMGB1蛋白表达降低,IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显降低。双荧光素酶报告基因实验显示HMGB1是miR-205的靶基因。结论 miR-205通过调控HMGB1改善LPS诱导的急性肾损伤,为脓毒症性AKI的治疗提供了新的方向。     

趋化因子CXCL10在心肌细胞及巨噬细胞中的表达机制

目的探讨心肌缺血-再灌注损伤中趋化因子CXCL10的产生机制。方法分别用LPS、H2O2、Ca2+载体A23187刺激原代培养的心肌细胞、骨髓来源的巨噬细胞或二者混合培养的共培养系统后,ELISA检测培养基上清中的趋化因子CXCL10和促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,观察其表达动力学。结果①大剂量(10μg/mL)的LPS刺激心肌细胞主要产生趋化因子CXCL10;刺激骨髓来源巨噬细胞主要产生促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α。②H2 O2、Ca2+通道激活剂并不能使产生趋化因子CXCL10或IL-1β、IL-6、TNF-α这些促炎性细胞因子。③骨髓来源的巨噬细胞促进心肌细胞表达趋化因子CXCL10;心肌细胞促进骨髓来源的巨噬细胞表达IL-6、TNF-α,但抑制IL-1β的表达。结论心肌细胞是心肌缺血-再灌注损伤中CXCL10潜在的细胞来源;CXCL10的表达,主要依赖于TLR4的激活。     

绿原酸对小鼠腹腔巨噬细胞免疫调节作用的研究

研究绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)对静息状态及脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)激活状态下小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。采用不同浓度的绿原酸作用于静息的和经LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,中性红吞噬实验检测巨噬细胞吞噬能力,Griess法检测NO的产生,酶联免疫法(ELISA)检测巨噬细胞细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10的分泌水平。试验结果表明在正常状态及LPS激活状态下,绿原酸均能提高下小鼠腹腔巨噬细胞的代谢活力、增强吞噬能力、增加NO、促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的分泌量,降低抑炎性细胞因子IL-10的分泌量,且作用效果呈剂量依赖性。     

miR-1252通过靶向调控TGF-β1-PI3K/Akt通路对高糖诱导的心肌纤维化的保护作用的机制

为了探讨miR-1252对高糖诱导的心肌纤维化的保护作用的机制,本研究通过小鼠的心脏的组化切片分析miR-1252敲除对糖尿病和正常小鼠心肌纤维化的影响,并且通过Western-blotting实验研究miR-1252调控高糖诱导的心肌纤维化的信号通路。结果表明:糖尿病且miR-1252敲除的小鼠心肌纤维化程度最高,且miR-1252敲除的成纤维细胞TGF-β1表达增高,TGF-β1能上调LOX、Akt和p-Akt蛋白的表达,但是需要PI3K蛋白的存在。本研究结果初步说明,miR-1252能通过调控TGF-β1-PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的心肌纤维化,且LOX是miR-1252主要的调控蛋白之一。     

大鼠心肌梗塞后心室重构中miRNA 的差异表达

目的：筛选大鼠急性心梗后的心室重构过程中差异表达的微小RNA(microRNA, miRNA),为miRNA 调控心室重构的机制 研究提供靶标。方法：20 只成年雄性Wistar 大鼠,分组如下：心肌梗死组(MI组,n=10)和假手术组(Sham 组,n=10)。通过结扎大鼠 左冠状动脉前降支构建急性心梗模型建模。4 周后对大鼠进行超声心动图检查和梗死边缘区心肌HE 染色观察心室重构程度。利 用miRNA芯片对心梗边缘区的miRNA进行差异表达检测,采用实时定量PCR验证芯片结果的可靠性。结果：心脏超声显示MI 组大鼠左室重构明显,心梗边缘区心肌HE染色可见细胞间质大量胶原纤维沉积。miRNA 芯片结果显示15 个miRNA在心梗4 周后呈差异表达,其中11 个miRNA(miR-21、miR-23a、miR-125b、miR-132、miR-146b、miR-181b、miR-199a、miR-320、miR-324、 miR-328 和miR-499)表达上调,4 个miRNA(miR-29、miR-30c、miR-133a 和miR-208)表达下调。实时定量PCR 验证结果与芯片结 果一致。结论：这些差异表达的miRNA 可能与心梗后心室重构相关,进一步深入研究特定miRNA 的调控机制有望为基因治疗提 供新靶点。     

IL-33通过活化巨噬细胞NF-κB信号通路参与低氧性肺动脉高压的发生发展

目的探讨IL-33/ST2应答轴是否通过激活巨噬细胞NF-κB通路促进低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)的发生、发展。方法采用野生型(WT)、IL-33转基因(Il33 Tg)小鼠和St2基因敲除(St2-/-)小鼠制备HPH小鼠模型,采集小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺组织标本;进行小鼠BALF总细胞和分类计数;用免疫荧光和免疫组化法检测IL-33、ST2在小鼠肺组织的表达水平和MAC-2+巨噬细胞聚集;用ELISA检测肺组织匀浆中的细胞因子含量;用免疫印迹(Western blot)检测转录因子NF-κB在模型鼠肺组织及体外IL-33刺激的小鼠巨噬细胞系RAW264.7的表达水平。结果 IL-33、ST2在HPH模型小鼠肺组织中表达上调并伴有MAC-2+巨噬细胞增加;Il33 Tg模型鼠肺部以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润;低氧可诱导WT小鼠肺组织表达促炎因子IL-1β和巨噬细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1),而St2基因缺失则下调上述细胞因子表达;低氧亦可诱导上调NF-κB在WT小鼠肺组织表达,而St2基因缺失则可抑制低氧诱导NF-κB的表达。体外实验显示IL-33能上调巨噬细胞NF-κB的表达。结论低氧可促进IL-33/ST2表达增强,进而诱导巨噬细胞内NF-κB通路的激活,导致促炎细胞因子MCP-1、IL-1β的产生,加重炎症反应并间接引起肺动脉血管重塑参与HPH的发生、发展。     

MiR-146a通过炎症参与小鼠糖尿病心肌病的机制研究

目的:探讨microRNA-146a (miR-146a)对小鼠糖尿病心肌病炎症的影响。方法:20只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和糖尿病心肌模型组,模型组利用链脲佐菌素(STZ,50 mg/kg)腹腔注射建立糖尿病心肌病模型,对照组给予等体积枸橼酸钠缓冲液,建模成功后提取心脏组织RNA,利用qRT-PCR检测心肌组织中miR-146a和炎症因子白介素1β(IL-1β),白介素6(IL-6),单核趋化因子1(MCP-1)以及NF-κB/p65的mRNA表达;依次分离原代心肌细胞,成纤维细胞和内皮细胞,给予高糖处理后,检测细胞中miR-146a,IL-1β,IL-6,MCP-1以及NF-κB/p65的mRNA表达;内皮细胞转染miR-146a mimic或miR-146a inhibitor,观察炎症因子的表达情况。结果:糖尿病心肌病心肌组织中miR-146a水平较对照组降低(P0.05),炎症因子IL-1β,IL-6,MCP-1以及NF-κB/p65的mRNA表达高于对照组(P0.05);与对照组相比,高糖分别处理原代心肌细胞和成纤维细胞后miR-146a表达未改变(P0.05),而高糖降低内皮细胞中miR-146a的表达(P0.05);高糖增加内皮细胞炎症因子IL-1β,IL-6,MCP-1及NF-κB/p65的mRNA水平(P0.05);内皮细胞转染miR-146a mimic后可阻止由于高糖所导致的内皮细胞中IL-1β,IL-6,MCP-1及NF-κB/p65的增加(P0.05),而转染miR-146a inhibitor后,可引起正常对照组细胞中炎症因子IL-1β,IL-6,MCP-1以及NF-κB/p65表达的增加(P0.05)。结论:糖尿病心肌病中miR-146a的降低以及炎症的增加,与内皮细胞受损相关,且可能通过miR-146a影响炎症因子的表达。     

miR-125b在急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者血浆中的表达及与肺功能和炎症细胞因子的关系

目的:探讨微小RNA-125b(miR-125b)在急性加重期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血浆中的表达及其与肺功能、炎症细胞因子的关系。方法:选择2016年11月至2019年1月应急总医院收治的69例急性加重期COPD患者作为急性加重组,并于同期随机选取58例稳定期COPD患者作为稳定组和50例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测各组血浆miR-125b表达水平;采用肺功能检测仪测定肺功能,包括用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气量(FEV_1)、FEV_1/FVC;采用酶联免疫吸附法测定血清炎症细胞因子,包括白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果:急性加重组血浆miR-125b表达水平高于稳定组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。急性加重组、稳定组肺功能指标FVC、FEV_1、FEV_1/FVC低于对照组,且急性加重组低于稳定组,差异有统计学意义(P0.05)。急性加重组、稳定组血清炎症细胞因子IL-6、IL-8、hs-CRP、TNF-α水平高于对照组,且急性加重组高于稳定组,差异有统计学意义(P0.05)。Pearson相关分析结果显示,急性加重期COPD患者血浆miR-125表达水平与FVC、FEV_1、FEV_1/FVC呈负相关(P0.05),与IL-6、IL-8、hs-CRP、TNF-α呈正相关(P0.05)。结论:miR-125b在急性加重期COPD患者血浆中异常表达,并与肺功能及炎症细胞因子密切相关,可作为临床辅助诊断及评估患者病情严重程度的参考指标。     

miR-487b在改善慢性心力衰竭中的作用机制

为了考察miR-487b在慢性心力衰竭发病过程中的作用及机制,本研究检测了miR-487b在慢性心力衰竭患者中的表达情况,通过冠状动脉左前降支结扎建立大鼠心力衰竭模型,并通过转染miR-487b模拟物和miR-487b抑制剂来调控其表达。研究发现,慢性心力衰竭患者心肌组织中mir-487b的表达水平显著低于健康人(p0.05)。此外,慢性心力衰竭模型大鼠心肌组织中miR-487b的表达也显著下调(p0.05)。上调miR-487b则有效抑制了慢性心力衰竭大鼠心肌细胞肥大,减少了胶原纤维和炎症细胞浸润程度(p0.05)。上调miR-487b还有效减少了心肌细胞凋亡(p0.05)。上调miR-487b则可显著升高大鼠心肌组织中SOD水平并降低MDA水平。采用ELISA法检测慢性心力衰竭患者和健康人血清中IL-33和ST2的水平,发现慢性心力衰竭患者和大鼠中的IL-33和ST2的水平均显著升高。此外,上调miR-487b可显著抑制IL-33和ST2mRNA和蛋白的表达。本研究表明miR-487b在慢性心力衰竭患者和大鼠中均显著下调;上调miR-487b的表达可显著改善慢性心力衰竭大鼠的心脏功能,抑制心肌纤维化和细胞凋亡,提高抗氧化能力;miR-487b可能通过抑制IL-33/ST2信号通路来发挥心脏保护作用。     

miR-19靶向PTEN并介导HMGB1影响小鼠动脉粥样硬化进程的机制研究

摘要 目的：探究miR-19靶向PTEN并介导HMGB1影响小鼠动脉粥样硬化进程的机制研究。方法：SPF级C57BL/6J ApoE^-/-雄性小鼠根据研究目的将实验小鼠分为对照组、AS模型组和miR-19抑制剂组。通过RT-PCR分析小鼠主动脉组织中miR-19的mRNA表达。通过蛋白印迹分析小鼠主动脉PTEN、HMGB1和AKT的蛋白表达。通过荧光素酶活性检测miR-19a与PTEN的靶向关系。通过组织学和红油O染色分析小鼠胸腹主动脉和主动脉窦中的AS斑块面积。通过RT-PCR分析小鼠主动脉主动脉弓内膜中促炎细胞因子和趋化因子的mRNA表达。通过蛋白印迹分析主动脉弓内膜中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达。结果：AS模型组miR-19mRNA表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组miR-19mRNA表达较AS模型组降低（P<0.05）。AS模型组PTEN蛋白表达较对照组降低,HMGB1和AKT蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组PTEN蛋白表达较AS模型组升高,miR-19抑制剂组HMGB1和AKT蛋白表达较AS模型组降低（P<0.05）。AS模型组主动脉和主动脉窦的斑块面积较对照组增加（P<0.05）,miR-19抑制剂组主动脉和主动脉窦的斑块面积较AS模型组减少（P<0.05）。AS模型组TNF-α、IL-β、IL-6和CXCL2的mRNA表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组TNF-α、IL-6、IL-β和CXCL2的mRNA表达较AS模型降低（P<0.05）。AS模型组ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达较对照组升高（P<0.05）,miR-19抑制剂组ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达较AS模型组降低（P<0.05）。结论：miR-19通过靶向调控PTEN表达激活HMGB1/PI3K/Akt信号通路,这可能会促进VSMCs的异常增殖、迁移和炎症反应,有助于AS的进展。     

炎症坏死和白介素1分泌的执行官:GSDMD

<正>Caspases是半胱氨酸蛋白酶,根据功能差异,这些Caspases分别属于凋亡Caspase或炎性Caspase.炎性Caspase包括人类(Homo sapiens)的Caspase-1,Caspase-4,Caspase-5和小鼠(Mus musculus)的Caspase-1,Caspase-11[1].高等动物的炎性Caspases主要表达于天然免疫细胞和部分组织细胞中,对病原感染或危险信号分子刺激产生应答,引起细胞的炎症坏死(pyroptosis)及细胞因子白介素1 beta(interleukin-1 beta,IL-1b)和白介素18的分泌等炎症     

大鼠心肌梗塞后心室重构中miRNA的差异表达

目的：筛选大鼠急性心梗后的心室重构过程中差异表达的微小RNA（microRNA,miRNA）,为miRNA调控心室重构的机制研究提供靶标。方法：20只成年雄性Wistar大鼠,分组如下：心肌梗死组（MI组,n=10）和假手术组（Sham组,n=10）。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支构建急性心梗模型建模。4周后对大鼠进行超声心动图检查和梗死边缘区心肌HE染色观察心室重构程度。利用miRNA芯片对心梗边缘区的miRNA进行差异表达检测,采用实时定量PCR验证芯片结果的可靠性。结果：心脏超声显示MI组大鼠左室重构明显,心梗边缘区心肌HE染色可见细胞间质大量胶原纤维沉积。miRNA芯片结果显示15个miRNA在心梗4周后呈差异表达,其中11个miRNA（miR-21、miR-23a、miR-125b、miR-132、miR-146b、miR-181b、miR-199a、miR-320、miR-324、miR-328和miR-499）表达上调,4个miRNA（miR-29、miR-30c、miR-133a和miR-208）表达下调。实时定量PCR验证结果与芯片结果一致。结论：这些差异表达的miRNA可能与心梗后心室重构相关,进一步深入研究特定miRNA的调控机制有望为基因治疗提供新靶点。     

下调miR-223表达对脓毒症心肌病小鼠心肌的保护作用及机制研究

摘要 目的：探讨下调miR-223表达对脓毒症心肌病（SCM）小鼠心肌的保护作用及其机制。方法：按随机数字表法将27只8-10 周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠分配至SCM模型（0 h,6 h,12 h,18 h,24 h）时相组、Normal组、SCM组、miR-223 antagomir NC组、miR-223 antagomir组,每组3只。腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）15 mg/kg构建SCM小鼠模型。miR-223 antagomir NC组与miR-223 antagomir组分别于建模前连续3天鼠尾静脉注射miR-223 antagomir NC、miR-223 antagomir预处理。采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）研究SCM模型各个时相组小鼠心肌组织miR-223的表达情况。采用苏木素伊红（HE）染色法观察Normal组、SCM组、miR-223 antagomir NC组和miR-223 antagomir组小鼠心肌病理形态变化。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定Normal组、SCM组、miR-223 antagomir NC组和miR-223 antagomir组小鼠血清cTnI、BNP、CK-MB、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量并进行相关性分析。结果：SCM模型时相组小鼠随刺激时间延长,心肌组织miR-223表达水平逐渐升高。与Normal组比较,SCM组、miR-223 antagomir NC组、miR-223 antagomir组小鼠心肌组织出现不同程度损伤;血清心肌损伤标记物cTnI、BNP、CK-MB及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平均上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;与SCM组比较,miR-223 antagomir NC组各项指标相差不大,差异均无统计学意义（P>0.05）;miR-223 antagomir组小鼠心肌组织病理损伤程度有所减轻,心肌损伤标记物cTnI、BNP、CK-MB及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。相关性分析结果显示小鼠miR-223表达与心肌损伤标记物cTnI、BNP、CK-MB及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达呈正相关。结论：下调miR-223表达可通过减轻炎症反应对SCM小鼠心肌产生保护作用。     

miR-106b在阿尔茨海默病中的作用机制

目的 探讨miR-106b在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发病中的作用.方法 取3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time PCR检测3、6、9月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中miR-106b的表达,对芯片检测结果进行验证;通过构建miR-106b稳定转染细胞系和miR-106b knockdown研究miR-106b与TGFBR2表达之间的关系; 构建TGFBR2 3'UTR-荧光素酶报告载体,验证miR-106b是否可以直接调控TGFBR2蛋白的表达;采用Western blot的方法检测APPswe/ΔPSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达情况.结果 miR-106b在3月龄和6月龄AD模型小鼠脑组织中表达升高,在9月龄模型小鼠脑组织中表达降低;通过体外实验,我们发现miR-106b与TGFBR2蛋白的表达呈负相关;荧光素酶报告实验表明TGFBR2 3'UTR序列中包含miR-106b的结合位点;TGFBR2蛋白在3、6、9、12月龄AD模型小鼠脑组织中表达均降低.结论 miR-106b可能通过调控TGFBR2蛋白的表达影响TGF-β信号通路,从而参与AD的发病.     

MiR-30e调控心肌肥厚的作用机制研究

目的:预测并鉴定miR-30e的靶基因,阐明miR-30e调控心肌肥厚的分子机制.方法:分离新生大鼠心肌细胞,用苯肾上腺素(PE)处理心肌细胞构建心肌细胞肥大模型,48小时后通过定量PCR方法检测miR-30e的表达水平变化.利用生物信息学方法预测miR-30e的靶基因,并通过荧光素酶报告基因实验和蛋白免疫印迹方法验证miR-30e的靶基因.结果:与对照组相比,PE处理48hr后,心肌肥厚标志基因nppa表达明显升高,肥大心肌细胞中miR-30e明显下调.生物信息学预测细胞骨架调控蛋白Twinfilin-1(Twf1)3'UTR有两个miR-30e的结合位点.过表达miR-30e能抑制含有Twf1 3'UTR的荧光素酶报告基因的表达,降低Twf1的蛋白表达水平.结论:Twf1为miR-30e的靶基因,miR-30e通过抑制Twf1的表达调控心肌肥厚.     

橄榄苦苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

为了探讨橄榄苦苷联合合心爽对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其保护作用机制,将50只健康大鼠分成假手术组、模型组、橄榄苦苷组、合心爽组、橄榄苦苷+合心爽组。经结扎冠脉左前降支制备心肌缺血再灌注大鼠模型,造模后药物处理7 d,用放射免疫法检测心肌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)含量,用比色法检测心肌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,用Western blot法检测心肌内皮素-1(ednothelin-1,ET-1)的表达。结果显示与假手术组相比,模型组心肌TNF-α、IL-1β、MDA的含量显著升高(P0.01),IL-10、SOD、CAT水平均显著降低(P0.01),心肌ET-1表达水平显著升高(P0.01)。与模型组比较,经橄榄苦苷或合心爽治疗后,心肌TNF-α、IL-1β、MDA的含量显著降低(P0.05,P0.01),IL-10、SOD、CAT水平均显著升高(P0.05,P0.01),心肌ET-1表达水平显著降低(P0.05,P0.01)。橄榄苦苷和合心爽联合治疗后心肌缺血再灌注损伤的恢复更加显著。通过本研究可以看出橄榄苦苷和合心爽对小鼠心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,其机制可能与降低心肌内皮素-1表达、改善抗氧化酶活性和抑制炎症因子水平有关。     

巨噬细胞特异性启动子/抗菌肽PR39基因腺病毒载体的构建及其表达

旨在构建由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,检测目的基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达。PCR扩增巨噬细胞启动子/抗菌肽PR39成熟肽基因序列,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack中,重组穿梭质粒(pAdTrack-SP/PR39)与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-SP/PR39)。pAd-SP/PR39经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-SP/PR39)。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。成功构建了由巨噬细胞特异性启动子调控的抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体。包装出的重组腺病毒仍然能感染小鼠巨噬细胞且高效表达抗菌肽PR39。构建的重组腺病毒能够在巨噬细胞中表达抗菌肽PR39基因,为靶向表达抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用奠定了基础。     

人IL-37b转基因对小鼠哮喘模型作用的研究

目的通过研究人抑制性细胞因子白细胞介素37b(interleukin 37b, IL-37b)转基因(transgenic, TG)小鼠(Il37b TG)对卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的哮喘气道高反应性、气道炎症和气道重塑等指标的变化,以及IL-37b在体外对小鼠和人肺结构细胞的作用,评估IL-37b在治疗哮喘方面的潜在意义。方法采用野生型和Il37b TG的雌性C57BL/6小鼠,建立周期为24 d的OVA诱导的哮喘小鼠模型,检测其肺力学参数、炎性细胞分类和Th2细胞因子表达以及肺组织病理学改变。体外采用原核细胞表达系统,获得大量纯化的重组人IL-37b。继而分别预处理小鼠肺成纤维细胞系(MLg)和人肺泡上皮细胞系(A549细胞),随后加以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,收集培养上清,采用双抗体夹心ELISA检测炎性细胞因子IL-6含量。结果与野生型OVA模型组相比,Il37b TG OVA组的气道高反应性降低,差异有统计学意义(P=0.000 1,P0.05);支气管肺泡灌洗液和肺组织中嗜酸性粒细胞数量降低,差异有统计学意义(分别为P=0.000 1和P0.000 1,P0.05);肺组织炎症细胞浸润明显减少,气道炎症、杯状细胞增生和黏液分泌均明显减轻,苏木精-伊红染色和过碘酸-希夫染色评分也有所降低,差异有统计学意义(分别为P=0.000 1和P=0.000 2,P0.05),马松染色显示急性期胶原沉积的改变不明显;肺组织匀浆中Th2型细胞因子IL-5和IL-13的含量均有所降低。同时研究采用原核细胞表达系统得到的IL-37b预处理鼠肺成纤维细胞MLg和人肺上皮细胞A549,可以降低LPS所诱导IL-6的产生。结论 IL-37b可能通过对相关靶细胞的负向调控进而发挥对哮喘气道的高反应性及气道炎症的抑制作用,为IL-37b作为一种新的治疗方法在临床治疗哮喘的潜在应用提供了一定的实验依据。     

应用原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系建立体外骨关节炎模型的效果评价

目的通过比较白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)处理对原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力、炎症因子与炎症通路表达水平变化的影响,为骨关节炎体外研究用细胞提供多重选择。方法免疫细胞化学法与甲苯胺蓝染色分别检测细胞中Ⅱ型胶原与蛋白多糖,鉴定所培养的原代细胞是否为软骨细胞。CCK-8法检测IL-1β(10ng/ml)处理24h、48h、72h对原代软骨细胞增殖活力的影响,IL-1β(1、10、20、40ng/ml)处理24h对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力的影响。IL-1β(10ng/ml)分别处理原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系细胞24h后,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)与基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达水平。Real-time PCR法检测核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)mRNA表达水平。结果所培养的原代细胞为原代软骨细胞。IL-1β(10ng/ml)处理可显著抑制原代软骨细胞增殖活力,但IL-1β(1、10、20、40 ng/ml)处理对SW1353软骨肉瘤细胞系增殖活力无明显影响。IL-1β(10ng/ml)处理可使IL-6、MMP-13表达水平及NF-κB mRNA的表达量均显著增加。结论IL-1β作用下原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系均可表现出骨关节炎样炎症反应,二者均可用于骨关节炎的体外实验研究。     

重组Osx腺病毒载体的构建及其调控成骨细胞增殖与分化的作用

构建表达成骨相关转录因子Osx的腺病毒,观察Osx对原代培养的小鼠成骨细胞增殖与分化的调控作用。将Osx编码基因克隆入腺病毒载体pAdEasy中,经293A包装后得到重组腺病毒,感染原代培养的小鼠颅骨细胞,茜素红染色观察矿化程度,实时定量RT-PCR检测成骨相关标志基因的转录水平,流式细胞检测细胞周期的改变。结果发现,①得到的病毒滴度为2×109PFU/ml,最佳感染复数为50;②表达Osx并不能够促进成骨细胞的矿化;③定量RT-PCR表明表达Osx 1d、3d、6d后成骨分化标志骨钙素、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达量明显上调(p<0.01);④流式细胞仪的结果表明Osx能够促进成骨细胞的增殖(p<0.01)。通过腺病毒在原代培养的成骨细胞中表达Osx能够促进成骨细胞的增殖,并对其分化具有一定的调控作用,为Osx在各种骨损伤的基因治疗应用方面提供了基础。