环腺苷酸(cAMP)对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响

通过外源添加环腺苷酸(cAMP)、腺苷酸环化酶激活剂氟化钠(NaF)和cAMP降解产物腺苷酸(AMP),研究了cAMP对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响,并测定了不同菌核发育阶段培养物的胞内cAMP浓度。结果表明:在测试浓度范围内,cAMP对粗柄羊肚菌菌丝生长影响不显著,但显著抑制该真菌菌核的发生。菌核数量与外源添加的cAMP和NaF具有明显的剂量负相关性。然而,AMP显著促进粗柄羊肚菌菌丝生长,却没有明显影响其菌核发生。培养物胞内cAMP浓度随着培养时间的延长而增加,与外源添加cAMP抑制菌核发生的结果一致。本研究为羊肚菌菌核发生的分子机制研究提供理论支持。     

羊肚菌菌核的交配型

交配型是调控真菌子实体发育和生活史的重要因子.作为羊肚菌生活史中一个有争议的阶段,菌核与交配型的关系研究甚少.以六妹羊肚菌Morchella sextelata和梯棱羊肚菌M.importuna为研究对象,以栽培菌包内的菌核和实验室单孢交配产生的菌核为研究材料,以Morchella sp.Mes-20单孢交配产生的菌核为参考,进行交配型分析.结果 发现:1)菌核的交配型呈明显的偏分离现象,六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌中交配型为MAT1-1的菌核远多于交配型为MAT1-2的菌核,而Morchella sp.Mes-20中MAT1-2菌核较多于MAT1-1的菌核;2)部分菌核含有2种交配型,但无法确定菌核是由异核体可育菌丝还是由2个交配型的单倍体不育菌丝缠绕组织化形成;3)部分菌核既不具有MAT1-1,也没有MAT1-2,出现交配型全部缺失现象.交配型缺失在羊肚菌菌种退化检测中的应用值得探寻,而羊肚菌菌核的偏分离和交配型缺失的机制及其与菌种选育和子实体产量之间的关系也有待深入研究.     

梯棱羊肚菌镉胁迫响应基因ATX1功能分析

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种可以大田覆土栽培的珍稀食用菌,而土壤重金属污染状况日益严重,对梯棱羊肚菌菌丝生长和子实体产品质量安全构成了潜在的威胁。本研究先采用镉离子胁迫处理梯棱羊肚菌菌丝体,RT-PCR检测发现候选基因ATX1的表达量显著下调。克隆梯棱羊肚菌ATX1基因,对ATX1p蛋白结构进行功能预测,发现ATX1p可能与铜离子转运及重金属胁迫相关。然后分别构建ATX1的超表达和RNAi基因沉默载体,采用农杆菌介导的转化方法,将其转入梯棱羊肚菌同核体菌株A50中,分别筛选到4个ATX1表达显著上调的超表达转化子和4个ATX1表达显著下调的RNAi基因沉默转化子,镉敏感性检测发现ATX1的RNAi基因沉默转化子表现为镉抗性增强,而ATX1超表达转化子则表现为镉抗性减弱。结果表明,梯棱羊肚菌ATX1基因表达与镉抗性呈负相关,ATX1p可能在梯棱羊肚菌镉胁迫响应过程中发挥着某种重要作用。     

梯棱羊肚菌营养类型的研究

羊肚菌是羊肚菌属Morchella中所有种的统称,其味道鲜美,深受人们的喜爱。目前,大多数羊肚菌物种仍然无法实现人工栽培,其重要原因之一就是它们营养类型仍然不甚清楚。梯陵羊肚菌M. importuna是少数可以人工栽培的羊肚菌之一,其腐生营养特性已经明确,但是否与植物根系存在共生营养关系仍然有疑问。为了探究梯陵羊肚菌菌丝与植物根系之间的相互关系,本研究选用梯棱羊肚菌2个不同交配型同核体菌株A2（MAT1-2-1）、A50（MAT1-1-1）和1个异核体菌株A59（MAT1-1-1和MAT1-2-1）为材料,将3个菌株分别与杂交白杨717（Populus tremula × P. alba,clone 717）进行共培养试验,观察菌丝与根系之间的互作情况。结果显示,A2、A50和A59菌丝体都能使杨树根系发生形态变化,产生明显的菌套（mantle）以及“Y”型菌根状结构,但均未观察到明显的哈蒂氏网（Hartig net）结构。研究表明,梯棱羊肚菌与杨树根系存在某种营养关系,但与外生菌根的共生关系不同。     

羊肚菌种袋栽培研究

羊肚菌的大田栽培已在我国进行了十余年,生产规模已超过10万亩,在不断高产出现的同时,区域性连作障碍、病虫害、较高的成本已成为制约产业发展的重要因素.以六妹羊肚菌菌株YAASMJNLM1-25和YAASMJNLM 1-31为材料,研究了1种羊肚菌栽培的新方法——种袋栽培技术,以常见的营养袋栽培方法为对照,进行了直接种袋栽培方法和间接种袋栽培方法研究.结果 表明:菌丝长满墒面的时间为8～23 d,现原基时间为55～91 d,第一次采收时间为77～110d,无论是直接种袋栽培法还是间接种袋栽培法,菌丝长满墒面的时间、现原基时间和采收时间均比撒播的营养袋栽培法长,即同一区域同一播种时间,六妹羊肚菌现原基时间和采收时间与菌丝长满墒面的时间相关;墒面污染率和袋(瓶)污染率分别为0～5％和0～25％,与撒播的营养袋栽培法相比,种袋栽培法的墒面和营养基质污染率显著降低,多数处理的污染率为零;试验的最低产量和最高产量分别为(295.00±8.66) g/m2和(466.89±33.67) g/m2,虽然组内有显著性差异的处理存在,但组间没有明显的规律性,这种显著差异的产生应该是羊肚菌的环境适应敏感性所致;种袋栽培法实现了羊肚菌菌丝向营养基质和土壤基质的双向生长,营养能有效向土壤基质转移,有利于稳产和减少病虫害;与营养袋栽培法相比,种袋栽培法减少了操作步骤,降低了生产成本.总之,2种方法的研究结果显示,羊肚菌出菇时间与菌丝长满墒面的时间密切相关,这对室内栽培及出菇机制的研究奠定了基础.     

温度对梯棱羊肚菌抗氧化酶活及其基因表达的影响

大田栽培条件下,环境温度无法精确调控,温度胁迫是影响羊肚菌生长发育的重要因素。抗氧化酶和抗氧化活性物质是羊肚菌抵御逆境胁迫的重要因子。温度胁迫下,羊肚菌菌丝会通过增加相应酶活性来减少活性氧的积累,降低对细胞的损伤。作者研究了不同温度对梯棱羊肚菌菌丝生长、抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽还原酶GR、谷胱甘肽过氧化物酶GPX）活性及其基因表达和抗氧化活性物质的影响,结果显示：在5-25℃的温度区间内,随着温度的增加,菌丝生长速度加快,菌丝的老化速度也加快;对抗氧化酶活性研究发现,SOD、GPX和GR在低温下活性更高,CAT在高温下活性更高;抗氧化活性物质含量会随温度升高而增加,如还原型抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）;温度越高,羊肚菌菌丝中H₂O₂、O^2-和丙二醛含量也随之增加。因此,在温度胁迫下,羊肚菌通过启动不同的抗氧化酶和抗氧化活性物质来减少活性氧含量,缓解菌丝损伤,本研究为探讨温度对羊肚菌种质质量的影响和栽培条件优化提供了基础数据支撑。     

羊肚菌栽培菌株遗传多样性分析及种特异性RAPD-SCAR标记开发

近年来中国的羊肚菌Morchella spp.栽培技术取得了长足进步,但基础研究薄弱影响其稳产和高产,国内外尚无羊肚菌栽培菌株种质资源遗传多样性的研究报道。本文对来自全国12省份的36个羊肚菌栽培菌株进行了ITS系统发育分析,并采用RAPD进行了遗传多样性评价。结果表明,结合有效的参考菌株序列,通过ITS序列分析可以将供试菌株进行区分和鉴定,在36个菌株中,26个菌株属于梯棱羊肚菌Morchella importuna,其他10个菌株属于六妹羊肚菌M. sextelata;将自40条RAPD引物中筛选出的14条用于供试菌株遗传多样性分析,共扩增出124条多态性条带;UPGMA聚类可将供试菌株分为两大类群,分别对应于ITS系统发育分析中的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌两个物种,梯棱羊肚菌种内菌株多态性高于六妹羊肚菌。OPA17引物和OPA18引物分别在AA02和AA15菌株中扩增出具有唯一性的特征条带,对两个特征条带进行回收测序后,设计出两个特异性SCAR的引物,它们能有效地从36个供试菌株群体中将菌株AA02和AA15鉴别出来。本文首次全面系统地采用ITS分析鉴别了我国羊肚菌栽培菌株的种性,采用RAPD分子标记系统地评价了羊肚菌栽培菌株的遗传多样性,并验证了RAPD分子标记转化为菌株特征性SCAR标记的可行性。     

外源β-胡萝卜素、光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响

初步研究了外源β-胡萝卜素和光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响。结果表明,在培养基中加入外源β-胡萝卜素后,PT95菌株渗出液出现的时间、菌核出现的时间延迟了,但菌核成熟的时间没变。培养基中的外源β胡萝卜素浓度越大,其渗出液、菌核出现的时间越迟。外源β胡萝卜素亦能降低PT95菌株的脂质过氧化水平和菌核中的类胡萝卜素含量。高氧胁迫的光照培养条件有利于PT95菌株的菌核分化和色素在菌核中的积累;与低氧胁迫的黑暗培养条件相比,其菌核生物量和类胡萝卜素产率分别增加了18.7%和101%。以上实验结果表明,若想获得高的菌核生物量和类胡萝卜素产率,应该尽可能在高氧胁迫、无抗氧化剂存在的条件下培养PT95菌株。     

外源β-胡萝卜素、光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响

初步研究了外源β-胡萝卜素和光照对青霉PT5菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响。结果表明,在培养基中加入外源β-胡萝卜素后,PT5菌株渗出液出现的时间、菌核出现的时间延迟了,但菌核成熟的时间没变。培养基中的外源β-胡萝卜素浓度越大,其渗出液、菌核出现的时间越迟。外源β-胡萝卜素亦能降低PT5菌株的脂质过氧化水平和菌核中的类胡萝卜素含量。高氧胁迫的光照培养条件有利于PT95菌株的菌核分化和色素在菌核中的积累;与低氧胁迫的黑暗培养条件相比,其菌核生物量和类胡萝卜素产率分别增加了18．7％和101％。以上实验结果表明,若想获得高的菌核生物量和类胡萝卜素产率,应该尽可能在高氧胁迫、无抗氧化剂存在的条件下培养PT5菌株。     

梯棱羊肚菌类膨大素蛋白Cerato-Platanin (CP)生物信息学分析及原核表达

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种珍稀食药用菌,经济价值极高,但其生活史及子实体发育过程并未完全明确,栽培技术尚不稳定.通过查阅文献和比对梯棱羊肚菌基因组信息,找到2个Cerato-platanin(CP,类膨大素)家族的基因,分别命名为Mi-CP1与Mi-CP2.采用生物信息学方法分析了Mi-CP1和Mi-CP2蛋白的结构及理化性质,构建了系统发育树,并采用qRT-PCR检测Mi-CP1和Mi-CP2基因在菌丝期、白菌核期、黄菌核期、原基期、幼菇期、成熟子囊果期6个不同生长发育阶段的相对表达量.结果 显示:Mi-CP1仅在菌丝期显著表达,而Mi-CP2在原基期和幼菇期大量表达,其中原基期是幼菇期的4.7倍,表明Cerato-platanin(CP)蛋白不仅与梯棱羊肚菌的营养生长有关,还可能参与了子囊果的发育.通过去除信号肽,分别构建pMAL-c2X-CP1X和pMAL-c2X-CP2X的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,结果仅Mi-CP1X蛋白成功诱导表达,而Mi-CP2X蛋白未能成功诱导表达,推测可能与使用的表达载体有关.本研究为揭示CP蛋白在羊肚菌生长发育过程中的作用奠定了基础.     

六妹羊肚菌PacBio基因组测序和DNA 6mA甲基化分析

羊肚菌属于子囊门真菌,是世界范围内最受欢迎的食用菌之一。本研究通过PacBio单分子实时测序技术对我国四川省成功栽培的六妹羊肚菌Morchella sextelata SCLS菌株进行全基因组测序,获得其高质量核基因组组装,大小为53.57Mb,重复序列含量为17.03%,包含42条重叠群（contigs）,重叠群N50高达1.82Mb,其中13条重叠群两端均含有端粒重复序列,为完整的染色体。通过链特异性RNA-seq测序和转录本拼接,并结合多种基因预测策略,预测到13 182个蛋白编码基因,包括267个碳水化合物活性酶,11个次生代谢产物合成基因簇。通过与内蒙古地区栽培的六妹羊肚菌菌株NZTD180501373基因组比较发现,六妹羊肚菌进化过程中可能发生过染色体重组事件,二者具有33 055个SNP和48 726个InDel位点差异,并且各自拥有超过6Mb的特有序列。此外,相比于梯棱羊肚菌M. importuna,六妹羊肚菌SCLS菌株中与逆转录转座酶有关的orthogroup发生了扩张,并且拥有5个成员数超过100的特有逆转录转座酶基因家族。对SCLS菌株中的DNA N⁶腺嘌呤甲基化（6mA）修饰进行了鉴定,发现SCLS菌株基因组中0.42%的腺嘌呤被6mA甲基化,其含量显著高于已报道的6种双核亚界（Dikarya）真菌。6mA甲基化位点在逆转录转座子上显著富集,表明六妹羊肚菌中6mA甲基化可能调控逆转录转座子的活性,这也是首次在真菌中报道6mA甲基化与转座子相关。     

羊肚菌不同单孢及不同萌发孔菌丝间的遗传多样性

本研究对来自不同单孢和不同萌发孔菌丝的166份羊肚菌菌株进行形态研究、交配型基因检测、基于ISSR的遗传多样性分析和菌株杂交选育。结果表明,来自不同单孢及其不同萌发孔菌丝培养的菌株间均存在不同程度的形态和遗传差异。4条ISSR引物共扩增出条带清晰的22条多态性谱带,多态性比率为88%。基于遗传相似性系数（GS）、不加权成对群算术平均法（UPGMA）构建的系统树,可将供试菌株分为梯棱羊肚菌Morchella importuna和六妹羊肚菌M. sextelata两大类群。聚类分析发现不同物种间的单孢菌株和单丝菌株的遗传差异显著;同一单孢不同萌发孔菌丝的菌株间存在较大的遗传分化,遗传多样性丰富。交配型基因检测证实羊肚菌是异宗结合型真菌,同一单孢的不同萌发孔菌丝体含相同的交配型基因（MAT 1-1-1或MAT 1-2-1）。遗传多样性结果表明：梯棱羊肚菌比六妹羊肚菌的遗传背景更广泛。此外,ISSR分子标记也表明仅依靠菌丝和菌核的形态特征并不能准确衡量羊肚菌菌株间的亲缘关系。研究羊肚菌单孢菌株、单丝菌株间的形态和遗传特征,将为羊肚菌优质菌种的精准选育提供理论参考。     

梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA1_1家族）,而AA1_2家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA1_2家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1_2家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA1_2家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA1_2多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64kDa,表现出亚铁氧化酶（EC 1.16.3.1）与漆酶（EC 1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH 4最高,漆酶活性在pH 6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn ²⁺、Hg ²⁺和Pb ²⁺抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。     

Carbon,nitrogen and phosphorus stoichiometry of Myrica nana in Yunnan,China

Aims Carbon (C), nitrogen (N) and phosphorus (P) play important roles in plant growth and physiological functions. We aimed at exploring the intrinsic relationships of C, N and P in Myrica nana—a common shrub in Yunnan Province—as well as their relationships with pant biomass and soil nutrients.
Methods We measured the concentration of C, N and P of M. nana from 29 sites for their magnitudes and correlations with soil nutrients.
Important findings 1) The arithmetic mean value of C, N and P concentration in the roots, stems and leaves of M. nana was 45.94%, 0.54%, 0.03%, and 46.32%, 0.58%, 0.03%, and 49.05%, 1.70%, 0.06%, respectively. C, N and P concentrations in the leaves were significantly higher than those in the roots and the stems. The C:N:P in roots, stems and leaves was 1531:18:1, 1544:19:1, and 818:10:1, respectively. 2) The C concentration and N:P in leaves of M. nana decreased with the increase of biomass of M. nana; the leaf C concentration was significantly correlated with biomass (p < 0.01), while the correlation between N:P and biomass was not significant (p > 0.05). The leaf N increased with the increase of plant biomass, the P was significantly correlated with biomass (p < 0.05), but the correlation between N concentration and biomass was not significant (p > 0.05). N:P in leaves was 34.2, suggesting that plant growth was limited by P. 3) C, N and P concentration in the roots were significantly correlated with soil P (p < 0.05), with N, P concentrations correlated with soil P positively (p < 0.01) and C negatively (p < 0.05). C concentration in the stems was significantly and negatively correlated with soil C, N, with significant correlation with C, N, and P concentration (p < 0.01). P concentration in the stems was significantly and positively correlated with soil P concentration (p < 0.01), while leaf P significantly and positively correlated with soil C, N and P (p < 0.01); leaf C concentration was significantly and negatively correlated with soil P (p < 0.01).     

地菇状马蒂菌的形态学及挥发性成分分析

在我国河北省保定市采集到稀有地下真菌地菇状马蒂菌Mattirolomyces terfezioides新鲜子囊果。子囊果个体较大,直径可达10 cm,不规则球状或块状,白色或乳白色,表面有浅开裂,基部有长柄或无。产孢组织中实,成熟时黄褐色。子囊典型的8个孢子;孢子球形,无色至淡黄色,表面具有钝刺,基部连接形成不规则网纹。可能与桃树共生。地菇状马蒂菌子囊果含有丰富的C8挥发性化合物,主要是3-辛酮,1-辛烯-3-醇和3-辛醇(共占总挥发性成分含量的75%左右),少量含硫化合物被检测到。该研究为地菇状马蒂菌在我国的分布提供了新的证据和标本记录,首次分析了其挥发性物质的组成,为地下真菌资源的保护、开发和利用提供新的资源和数据支持。     

致死性中线肉芽肿分离的不规则毛霉与米根霉致小鼠非典型增生研究

致死性中线肉芽肿（LMG）与鼻眶脑真菌病（ROCM）均为发生于面中线部位的损毁性溃疡,有时LMG可合并真菌感染,后者常被认为是继发。我们从LMG组织中分别分离出不规则毛霉（PUTH 10050641）和米根霉（PUTH 20111112）,病人均经抗真菌治疗获得痊愈,我们因此推测PUTH 10050641和PUTH 20111112可能参与诱导非典型增生及CD-56和Ki-67抗原表达。为论证上述推测,我们用ICR小鼠设计了一项观察研究。方法为小鼠背部皮下接种PUTH 10050641和PUTH 20111112,分别于接种后1周、2周、3周、4周和5周进行皮肤标本培养和组织学分析,包括直接免疫荧光和免疫组化特征。结果成功诱发感染并形成溃疡,病理表现为多形细胞浸润性炎症、血管侵入。此外,一些区域出现非典型增生、CD-56和Ki-67抗原表达,其中Ki-67高表达围绕真菌菌丝周围。上述研究表明不规则毛霉PUTH 10050641和米根霉PUTH 20111112参与了诱导非典型增生及NK细胞聚集。     

根癌农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系的构建

以巨大口蘑菌丝为受体材料,利用含有双元质粒plasmid4的根癌农杆菌EHA105介导,首次成功建立了巨大口蘑的遗传转化体系。通过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和绿色荧光蛋白的检测,表明潮霉素抗性基因（Hyg）已经整合到巨大口蘑基因组中,增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）在巨大口蘑菌丝中获得表达,并能够稳定遗传。本研究建立了农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系,为今后巨大口蘑的基因功能研究奠定了基础。