多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

水稻锌指蛋白OsRZ3基因克隆及融合蛋白的原核表达、纯化

根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定位检测表明其在细胞核。构建pGEX6P-3::OsRZ3融合载体,电转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经1 mmol·L-1IPTG小量诱导表达,SDS-pAGEX蛋白电泳表明60 kD融合蛋白4 h最大;在LB液体培养中0.5 mmol·L-1IPTG过夜大量诱导表达,通过GST吸附柱层析获得大量包涵体纯化蛋白,1L菌液可诱导纯化到浓度1.58 mg·mL-1包涵体融合蛋白。所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达pGEX6P-3::OsRZ3融合蛋白,0.5 mmol·L-1IPTG大量诱导,通过GST柱吸附获得包涵体纯化蛋白,为作进一步的抗体制备和染色质免疫共沉淀等DNA结合的特性研究准备了基础。     

运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用培养基

本研究采用氨基酸分析法结合DOE设计法优化并获得高表达抗PD-1单克隆抗体生产用基础和补料培养基。通过对市售多种基础和补料培养基进行筛选,获得细胞生长状况较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基,利用氨基酸分析法检测较优基础培养基和补料培养基中氨基酸消耗情况,确定影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类,利用DOE分析软件设计分别在较优基础和补料培养基中添加不同浓度的氨基酸种类及浓度,根据细胞生长及抗体表达,优化得到抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基组合。最终优化后基础培养基配方为:Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺。最终优化后补料培养基配方为:OPM CHOCD Feed1补料培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸,75.0 mmol/L L-酪氨酸,64.0 mmol/L L-丝氨酸,49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。经过3 L反应器培养验证,优化后的培养基比未优化时,最大活细胞密度(PVCD)提高了62.7%,抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5%,且活性无明显差异。     

微量元素对籼稻愈伤组织分化成苗的影响

通过研究MS培养基中碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴以及铁8种微量无素对愈伤组织分化成苗的影响,结果表明:缺少碘、硼、锰、锌、钼、钴的培养基对籼稻愈伤组织分化成苗影响不大,而缺少铜和铁的培养基对籼稻愈伤组织分化成苗影响很大,添加不同浓度铁和铜元素的试验表明,在铁盐浓度为0.10mmo1.L-1,铜浓度为1.5×10-4mmo1.L-1时,分化成苗效果较好,而铁盐浓度分别在0.05mmol.L-1、0.15mmol.L-1、0.20mmol.L-1、0.40mmol.L-1,铜浓度分别在0.5×10-4mmol.L-1、1.0×10-4mmol.L-1、2.0×10-4mmol.L-1、4.0×10-4mmol.L-1时,对籼稻分化成苗和生长均不利。     

南蛇藤原生质体培养及植株再生

以4℃低温暗处理24 h的南蛇藤胚性愈伤组织为分离原生质体的原材料,用MS培养基进行液体浅层静置、固液双层以及琼脂糖包埋培养原生质体,获得再生愈伤组织并分化成苗,建立了原生质体培养体系。结果表明,低温暗处理利于高产率高质量原生质体的获得;0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+5 mmol.L-1MES为酶的最佳配方;12 h为最佳酶解时间;13%为甘露醇最佳浓度;静置12 h+振荡0.5 h为最佳酶解方式;液体浅层静置培养取得了较好的原生质体培养效果;MS+6-BA2.0 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1为愈伤组织最佳分化培养基;1/2MS+NAA0.1 mg.L-1为最佳生根培养基。     

融合牛肠激酶轻链EKL包涵体蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵表达肠激酶轻链融合蛋白DsbA-rEKL,主要以包涵体形式存在。包涵体经4mol/L尿素和0.5%TritonX-100洗涤,以6mol/L盐酸胍、100mmol/LDTT溶解,在胱氨酸存在下,以脉冲加样方式复性。融合蛋白复性在6mmol/L胱氨酸存在下、脉冲加量0.03mg/mL和复性终蛋白浓度0.3mg/mL为最佳复性方案。复性的融合蛋白加2mmol/LCaCL2后快速自切。经IDA-Sepharose及Q-Sepharose纯化,rEKL纯度可达95%以上,可高效酶切重组瑞特普酶融合蛋白Trx-rPA。实现了大规模生产rEKL,每升发酵液经复性及纯化后,可得rEKL60mg/L以上,使以融合蛋白表达rPA等药用蛋白成为现实。     

外源亚精胺对不同盐浓度下黄瓜幼苗可溶性蛋白表达的影响

采用营养液水培的方法,以黄瓜品种‘津春2号’为试材,研究了叶片喷施外源亚精胺(Spd)对不同浓度NaCl(0、50、75、100 mmo.lL-1)胁迫下幼苗植株可溶性蛋白表达的影响。结果表明,50 mmol.L-1NaCl胁迫下植株叶片和根系中可溶性蛋白含量提高;75 mmol.L-1和100 mmol.L-1NaCl胁迫明显降低了幼苗植株叶片和根系中可溶性蛋白的含量。不同浓度NaCl胁迫下喷施Spd后可溶性蛋白含量在根系中没有明显变化规律,而叶片可溶性蛋白含量提高。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对黄瓜幼苗根系可溶性蛋白分析表明,至少有3种分子量约为61.5、50、47 kD蛋白在50 mmo.lL-1和75 mmol.L-1NaCl胁迫下表达量增强,但100 mmo.lL-1NaCl胁迫下变化不明显;50 mmol.L-1和75 mmol.L-1NaCl胁迫下喷施Spd后61.5 kD和47 kD蛋白表达量明显减弱,50 kD蛋白甚至消失,100 mmol.L-1NaCl胁迫下61.5 kD和47 kD蛋白无明显变化,50 kD蛋白反而增强。     

离子转运蛋白调控钝齿棒杆菌离子和pH稳态促进L-精氨酸合成

L-精氨酸是一种半必需氨基酸,广泛应用于食品、制药、饲料等行业。【目的】当前对L-精氨酸生产菌株的研究,极少涉及离子转运领域。在本研究中,发现在发酵时适量添加外源K~+有利于促进钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5合成L-精氨酸。【方法】在C. crenatum SYPA5-5发酵培养基外源添加0.5 g/L和2.5 g/L的K_3PO_4,取对数期发酵样品进行转录组数据分析,挖掘出K~+转运相关的阳离子转运ATP酶CTAP1以及单价阳离子/H~+逆转运蛋白Mrp1A,研究其在C. crenatum SYPA5-5快速合成L-精氨酸阶段,对菌株生长及L-精氨酸合成的影响。【结果】对基因ctap1和mrp1分别进行敲除和过表达,深入研究突变株对L-精氨酸合成的影响。研究发现同时过表达离子转运蛋白CTAP1和Mrp1A更有利于胞内离子、pH稳态和渗透压调节,最终提高L-精氨酸的产量。在补料分批发酵中分别过表达Mrp1A、CTAP1以及同时过表达Mrp1A和CTAP1的菌株L-精氨酸产量分别达到61.4 g/L、63.9 g/L和65.3 g/L,产率分别为0.383 g/g、0.392 g/g和0.395 g/g,比C. crenatum SYPA5-5分别提高了34.9%、38.0%和39.1%。【结论】CTAP1是特异性的K~+转运ATP酶,可以将培养基中的K~+运输到胞内。同时Mrp1A可将胞内K~+和Na~+等单价阳离子运输到胞外,将胞外H~+运输至胞内,中和胞内L-精氨酸所导致的碱性环境,从而维持胞内pH稳定。CTAP1和Mrp1A的研究为解析离子转运机制和L-精氨酸合成之间的联系奠定了基础。     

抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中表达条件的优化

优化抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中的表达条件,提高表达量。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个单因素实验入手,优化QX3-1融合蛋白的表达条件,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Band Scan凝胶分析软件分析QX3-1融合蛋白的表达量。p ED-QX 3-1/BL21重组菌在LB、大豆肉汤、TB和酪蛋白胨(自制) 4种培养基中,于酪蛋白胨培养基中的表达量最高;在20、25和37℃三种诱导温度下,于37℃环境中表达量最高;在1、5、10、15和20 mmol/L乳糖浓度的诱导下,于10 mmol/L乳糖诱导最佳;在30 h的诱导时间内,于第24小时,融合蛋白的表达量最高。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个变量中筛选出适合QX3-1融合蛋白表达的最佳组合,使融合蛋白的表达量达到了31. 2%,相比未优化前提高了近一倍。     

轮叶党参的组织培养及植株再生研究

以轮叶党参为材料,研究了不同外植体、激素组合、培养基及光照条件对愈伤组织诱导及植株再生的影响.结果表明,叶片是轮叶党参组织培养较为合适的外植体.外植体在添加0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) KT的MS培养基上愈伤组织诱导率最高可达100%;愈伤组织转移到附加0.75 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) NAA的MS培养基进行继代培养,增殖后的愈伤组织转移到附加0.5 mg·L~(-1) 6-BA+0.2 mg·L~(-1) NAA的1/2MS分化培养基进行分化,其分化率达89.4%;将分化出的芽转接到附加0.2 mg·L~(-1) IAA+0.2 mg·L~(-1) NAA的1/2MS培养基,生根率达92.5%.暗培养诱导出愈伤组织后转到16 h·d~(-1)光照条件下,愈伤组织增殖倍数和分化率显著提高,再生苗健壮,长势强.     

叠氮化钠诱变玉扇愈伤组织的研究

在含不同浓度叠氮化钠（0、0.01、0.05、0.1、0.5和1.0mmol·L~（-1））的诱导培养基上诱导玉扇愈伤组织发生变异。结果表明,叠氮化钠对玉扇愈伤组织的半致死浓度为0.1～0.5 mmo1·L~（-1）,0.1 mmol·L~（-1）有利于保证一定量的有效变异率和再生率。再生芽多发生叶片失绿、畸形和叶序改变,其中较多的叶序变异,有望为研究叶序决定提供材料。     

矮丛蓝莓叶片的愈伤组织诱导及植株再生

以矮丛蓝莓'Blomidon'品种的试管苗叶片为外植体,研究不同培养基、激素、转接时间以及转接方式对愈伤组织诱导及植株再生的影响.结果表明:WPM1/2为适宜的培养基;添加0.5 mg·L~(-1) CPPU+1.0 mg·L~(-1) ZT+0.5 mg·L~(-1) TDZ和0.5 mg·L~(-1) CPPU+0.5 mg·L~(-1) ZT+1.0 mg·L~(-1) TDZ诱导愈伤率较高达100%;ZT、CPPU与生长素IAA、IBA的配比诱导愈伤率效果不佳;添加ZT诱导的愈伤组织适合20 d后转接,CPPU诱导的愈伤组织适合50 d后转接;转接方式均以固体培养为宜.矮丛蓝莓'Blomidon'最适宜培养基为WPM1/2+0.5 mg·L~(-1) CPPU+1.0 mg·L~(-1) ZT+0.5 mg·L~(-1) TDZ,其诱导愈伤组织50 d后转接平均分化芽数最多达10.26个.     

濒危中药材太白米组织培养及总黄酮含量测定

以太白米(Notholirion bulbuliferum)地下小鳞茎为外植体,通过在MS基本培养基添加不同浓度2,4-D、KT、TDZ和NAA,研究不同植物生长调节剂对太白米愈伤组织诱导的影响.结果显示,4种植物生长调节剂在不同水平上对愈伤组织诱导有显著作用(2,4-D、TDZ,P<0.01;NAA、KT,P<0.05),诱导愈伤组织的最佳激素组合是0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.5 mg·L~(-1) NAA+0.2 mg·L~(-1) KT+0.1 mg·L~(-1) TDZ,愈伤组织在该培养基上继代培养有不定芽分化,如用相同浓度ZT代替KT则分化的不定芽增多.HPLC分析显示野生小鳞茎、愈伤组织和不定芽中总黄酮含量无显著差异,分别为干重的13.3%、11.4%和11.9%.     

四倍体刺槐无性系K2和K3的组织培养

1997年,北京林业大学从韩国引进了具有速生和饲料用途的刺槐(Robinia pseudoacacia L.)四倍体优良无性系,目前已在全国各省区试推广.与普通刺槐相比,四倍体刺槐具有叶大、速生等优点,且较普通刺槐有更强的适应性,耐干旱、贫瘠、烟尘及盐碱能力强,成林快,是水土保持、防风固沙及退耕还林的良好树种,可作为西北地区造林的先锋树种.     

正交设计法优化三岛柴胡愈伤组织培养基

目的:优化三岛柴胡愈伤组织培养条件。方法:采用正交设计法,以相对生长速率、鲜重和干重为考察指标,对三岛柴胡愈伤组织生长的MS培养基成分进行单因素多水平和多因素多水平考察。结果:最佳培养基为:MS+3%蔗糖+10/40mmol.L-1NH4+/NO3-+3.75mmol.L-1HPO24-+NAA(0.005mg.ml-1)+6-BA(0.010mg.ml-1)。最佳培养条件下,愈伤组织相对生长速率为0.1548,干重达0.1668g.瓶-1。结论:2,4-D与NAA配合使用可以促进三岛柴胡愈伤组织快速生长,L9(34)正交设计实验中愈伤组织干重明显高于单因子实验设计的。     

泰国野生银边姜黄的组培快速繁殖

利用泰国野生银边姜黄的萌动芽做外植体 ,对泰国野生银边姜黄的离体快速繁殖进行了研究 ,旨在为银边姜黄在中国的扩大栽培提供技术支持。筛选出了泰国野生银边姜黄萌动芽的恢复生长培养基 :MS +6 BA 0 .8mg.L 1+NAA 0 .1 5mg.L 1;芽增殖培养基 :MS +6 BA 4mg.L 1+KT 1 .5mg .L 1;生根培养基 :MS+NAA 0～ 0 .5mg.L 1。     

五唇兰种子离体培养的研究

授粉90d的五唇兰种子95%具球形胚,无菌条件下播种于培养基3个月后种子最高萌发率达到 90%。ABA和高浓度的NH4NO3抑制种子的萌发。NAA和BA促进种子的萌发,最适浓度为BA0.2mg· L 1+NAA0.5mg·L 1。400mg·L 1的谷氨酰胺可促进原球茎生长。2000mg·L 1的蛋白胨促进原球茎发 育成苗。     

菊花近缘种属植物耐盐筛选浓度的确定及耐盐性比较

以纪伊潮菊(Ajania shiwogikuvar.kinokuniense)、牡蒿(Artemisia japonica)、黄金艾(Artemisia vulgaris)、乙立寒菊(Dendranthema indicumvar.maruyamanum)为试材,研究在Hogland营养液水培条件下,添加NaCl后使之浓度分别为0、75、100、150、250、400mmol.L-1,观察不同水平NaCl胁迫对植株外观形态的影响,以确定菊花近缘种属植物耐盐性筛选的适宜浓度,结果表明:4种植物在100、150mmol.L-1NaCl的盐胁迫下筛选效果良好,此浓度下物种间出现症状差异明显的时间分别是10d以上和6d以上;在120mmol.L-1NaCl胁迫下,根据外观形态结合盐胁迫对植株根系活力、丙二醛和叶绿素含量的影响,对4种植物耐盐性强弱进行比较,利用隶属函数法得出4种植物耐盐性自弱到强的顺序为:乙立寒菊<纪伊潮菊<黄金艾<牡蒿,与利用50%叶面积受害为筛选依据得出的结论一致。     

锰对锰超积累植物美洲商陆抗氧化系统的影响

采用水培法,研究了美洲商陆在不同锰浓度下的生长、锰积累、H₂O₂含量、脂质过氧化以及抗氧化系统的响应.结果表明：植株锰含量随锰浓度增大而显著增加,依次为叶＞茎＞根.低浓度锰（5 mmol·L^-1）显著促进植株生长,叶片中H₂O₂含量明显降低,丙二醛（MDA）含量与对照相当;高浓度锰（≥10 mmol·L^-1）抑制植株生长,叶片中H₂O₂和MDA水平显著增加,表明叶片中发生了明显的氧化损伤.抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶的活性和还原型抗坏血酸水平随锰处理浓度上升;超氧化物歧化酶活性在低浓度锰时显著降低,高浓度锰时则显著上升;过氧化氢酶和过氧化物酶活性、还原型谷胱甘肽含量在锰浓度为5～10 mmol·L^-1时显著上升,而在20 mmol·L^-1时明显回落.说明氧化损伤及锰积累可能是高浓度锰下美洲商陆生长受抑的生理原因.锰处理下,抗氧化系统效率提高可以部分解释美洲商陆耐锰和超积累锰的特性,不同抗氧化剂活性或含量随介质锰浓度变化的模式不同,反映了其在美洲商陆耐受不同浓度范围锰时的作用不同.