2008～2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

为了解2008~2009年珠海市H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况,选择珠海市2008~2009年期间不同时间点的经狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型流感毒株20株,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增HA1基因片段,将产物纯化并测序,推导氨基酸序列,进行基因进化特性分析。与同时期的疫苗株比较,2008年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇的氨基酸位点变异数少于4个;2009年珠海市流行的H3N2亚型流感毒株除09-0056外,HA1区存在5个位于抗原决定簇内的变异氨基酸位点。2008年H3N2亚型流感毒株的HA1区的糖基化位点与疫苗株一致;2009年H3N2亚型流感毒株HA1区丢失第144位糖基化位点。2008~2009年H3N2亚型流感毒株RBS氨基酸序列未见明显变异。与2008年H3N2亚型流感毒株比较,2009年H3N2亚型流感毒株HA1区抗原决定簇内存在多个位点的氨基酸替换。这些说明2008年珠海市流行的H3N2亚型流感病毒不是新变种;2009年流行的H3N2亚型流感病毒为新的变异株,这可能是H3N2亚型流感病毒在2009年6-9月为珠海地区季节性流感流行优势株的原因。     

海南省2016-2018年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒基因特性分析

2009年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒在墨西哥暴发,之后在全世界流行。为了解海南省2016-2018年A(H1N1)pdm09亚型流感病毒流行态势,分析血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征与变异情况,本研究从中国流感监测信息系统获取海南省2016-2018年流感病毒病原学监测数据,选取5家流感监测网络实验室分离鉴定的37株A(H1N1)pdm09亚型流感毒株进行HA与NA基因测序,利用MEGA 10.1.8构建HA与NA基因种系进化树,并分析其氨基酸变异情况。结果显示,2016-2018年共出现3次A(H1N1)pdm09亚型流感病毒活动高峰。2017年10月份以后的分离株(4/8)与2018年大部分分离株(21/22)独立于疫苗株A/Michigan/45/2015聚为一个小支,发生20余处HA与NA氨基酸位点变异。与疫苗株A/California/7/2009(2010-2016)相比,2016-2018年流感病毒分离株在HA基因抗原决定簇上发生7处氨基酸变异并有一个潜在糖基化位点,未发现HA基因受体结合位点变异与NA基因耐药性变异。本研究提示,2016-2018年,A(H1N1)pdm09亚型流感病毒逐步发生规律性进化,氨基酸变异频率有增加趋势,今后应持续加强流感病毒病原学监测,密切追踪A(H1N1)pdm09亚型流感病毒基因变异情况,为科学防控提供理论依据。     

2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。     

A(H3N2)亚型流感病毒血凝素基因特性及蛋白结构分析,以南宁市2009～2012年为研究案例

利用生物信息学软件和数据库研究南宁市2009~2012年度A(H3N2)亚型流感病HA基因的遗传变异规律及蛋白结构变化。通过RT-PCR扩增H3N2病毒HA基因并测序,同源比对统计毒株氨基酸位点的差异、构建系统进化树分析进化规律和同源建模分析蛋白结构的变化。系统进化树表明53株HA基因序列被分为4个类群,呈多侧支流行;所有毒株的二硫键和受体结合位点(RBS)高度保守;部分毒株HA在第45位点增加一个糖基化位点,在第144位点丢失一个糖基化位点;HA抗原决定簇氨基酸累计有30个位点发生变异,涉及5个抗原决定簇;HA晶体结构分析抗原决定簇突变位点主要发生在无规则卷曲处,大多数替换的氨基酸种类和性质相同或相似。南宁市A(H3N2)亚型流感病毒株变异活跃,2012年A(H3N2)亚型流感病毒与当年WHO推荐的疫苗株具有较远的进化距离,多数毒株具备了形成新变种的条件,是否形成新的流行株,有待深入研究。     

2011～2012年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为了解2011～2012年监测年度我国分离的H3N2亚型流感病毒流行和变异特点,本文对2011年4月至2012年3月流感监测年度中国大陆分离的H3N2亚型流感毒株进行了抗原性和基因特性研究。结果显示,2011年我国大陆H3N2亚型流感病毒活动水平较低,2012年1月以来活动水平逐渐升高并于3月初成为流行优势株。H3N2亚型流感病毒中大部分毒株与疫苗株A/PER/16/09(87.2%)和国内代表株A/FJ/196/09(76.0%)抗原性类似,但2012年以来低反应株比例有升高趋势,基因特性分析大部分低反应株主要集中在Vic/208分支上,HA晶体结构分析发现与疫苗株相比,近期毒株在抗原决定簇A区、B区和C区均发生了氨基酸位点突变,而且在HA的45位,NA的367位各增加了一个糖基化位点。总之,虽然在此流感监测年度中我国大陆流行的大多数H3N2亚型流感病毒与疫苗株和国内代表株类似,但是随着低反应株的逐步流行,需要及时监测疫苗的保护效果并及时更换疫苗株。     

1968−2014年中国甲型H3N2流感病毒PB1基因进化分析

【目的】分析季节性H3N2流感病毒PB1基因序列的变异情况,揭示H3N2流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势。【方法】对1968?2014年中国地区82株人H3N2毒株、2012?2014年江苏省分离的81株甲型H3N2流感病毒、6株SIV和4株AIV H3N2亚型PB1、PB1-F2基因进行分子进化分析。【结果】1968?2014年中国H3N2流感毒株PB1核苷酸和氨基酸相似性分别为90.91%?100%和96.91%?100%。系统进化树分析,1968?2014年共173株H3N2流感病毒总体上分为4个分支,2002?2014年分离毒株位于第IV分支上,1968?1994年分离毒株位于第II和III分支;猪源H3N2亚型分布于第I、II、IV分支上;分子特征显示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后发生适应性改变,替换了原来的氨基酸;PB1-F2基因编码截断型蛋白长度有52、34、25、24、11 aa (猪源),PB1-F2蛋白毒力关键位点上未出现高致病性特征突变。【结论】自1968年起H3N2亚型PB1基因变异逐步趋于稳定,且PB1-F2截断型毒株正逐渐成为一类新的进化特征,但PB1基因与其他亚型之间发生重配以及关键毒力位点的变异仍应是监测的重点。     

2017年河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化和抗原性分析

【背景】H9N2亚型禽流感病毒在鸡群中广泛流行,引起巨大损失。【目的】了解河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的基因序列和抗原性的变异情况,为该病原的科学防控提供理论依据。【方法】于2017年从河北省部分蛋鸡养殖场分离鉴定出7株H9N2亚型AIV,对其HA基因进行序列测定,并进行遗传演化、关键氨基酸位点及抗原性分析。【结果】7株分离毒株HA基因同源性在95.5%?97.2%之间;与2016年前的流行毒株相比,分离病毒HA裂解位点均为典型低致病性AIV特征,在受体结合区域出现变异,潜在糖基化位点无明显差异;抗原分析结果显示分离毒株与早期分离株相比抗原性发生了变异,形成了新的抗原群;抗原性相关位点分析显示,分离毒株在9个位点发生了较为明显的突变,可能是导致抗原性变异的分子基础。【结论】河北省蛋鸡养殖场H9N2亚型AIV中的流行毒株在关键功能区发生基因突变,并且抗原性发生变异,提示应持续监测H9N2亚型AIV的遗传变异情况,并及时更换疫苗株。     

一株达菲耐药的甲型H1N1流感病毒全基因特征分析

目的分析1株甲型H1N1流感达菲耐药病毒株的全基因特征,为指导流感临床治疗与防控提供依据。方法采用鸡胚进行病毒分离,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其全基因组8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列,绘制基因进化树并分析重要基因位点变异情况。结果 A/Fuzhou/SWL11609/2013(H1N1)流感毒株的8个节段基因均处于2013-2014年度进化簇中,且与A/California/07/2009(H1N1)疫苗株高度同源,8个基因同源性均在97.4%以上;其HA和NA基因与A/Hubei-Wuchang/SWL1322/2013(H1N1)达菲耐药株同源性最高,分别为100.0%和99.6%;初步判断该毒株未发生重配现象,其重要致病性基因位点未发生变异;NA基因中具有H275Y典型达菲耐药位点特征,缺失一个糖基化位点(N386K),降低了基因结构的稳定性,同时在V241I和N369K的作用下降低了病毒的适应性。结论本次研究的甲型H1N1流感达菲耐药病毒株表现为低致病性流感病毒特征,但具备较好的人传人能力,需进一步加强监测,谨防耐药株的广泛流行。     

湖南省2009～2011年甲型H1N1流感哨点监测病原学结果及病毒基因特性分析

了解和掌握2009～2011年湖南省甲型H1N1流感流行动态和变化规律,掌握甲型H1N1流感流行株基因特性及耐药性情况。收集哨点医院采集的流感样病例咽拭子标本,通过荧光PCR法或病毒分离法对流感病毒进行检测,选取部分阳性毒株进行基因序列测定,序列使用MEGA 5.05软件完成进化分析。2009年第20周至2011年52周,共检测标本17 773份,检出流感阳性标本3 831份,检测阳性率为21.6%,其中甲型H1N1流感阳性标本1794份,占流感阳性的比例为46.8%。甲型H1N1流感共有2个流行高峰,分别出现在2009年第41～53周和2011年第1～12周。测序的23株毒株HA基因亲缘关系较近,病毒在基因进化树中基本上按照时间顺序分布。全基因组序列分析显示7株毒株的所有8个基因片段均与疫苗株同源,并未发现基因重配。23株毒株的HA氨基酸位点相对于疫苗株高度相似(同源性为98.2%～100%),但均有P83S、S203T和I321V的突变。在A/Hunan/YQ30/2009毒株中发现了可能导致病毒毒力增强的222位点突变,突变为D222E。所有检出毒株均未发现对奥斯他韦耐药性的突变。2009～2011年湖南省甲型H1N1流感流行呈双峰分布,未发现病毒基因发生大规模变异,临床上使用奥斯他韦仍然是有效的。     

长沙A(H1N1)亚型季节性流感暴发疫情的实验室诊断及其HA基因特性分析

对2009 年长沙麓山国际学校流感暴发疫情进行实验室诊断, 并探索新分离的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素(HA)的基因特性。对流感暴发疫情的25 份鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离, 然后利用CEQ?8000 Genetic Analysis System对病毒分离株(A/Yuelu/314/2009)进行测序, 测序结果提交至GenBank(登录号: FJ912843)并用ClustalX和Mega4.1软件进行序列分析。结果显示, 分离出A(H1N1)亚型流感毒株18株, 检出21份A(H1N1)亚型流感病毒核酸阳性; A/Yuelu/314/2009(H1N1) HA基因序列与2008~2009 年疫苗株(A/Brisbane/59/2007)比较显示: 核苷酸和氨基酸同源性均为99%, 有6个位点的氨基酸发生了变异(V148A、S158N、G202A、I203D、A206T、W435R), 其中一个S158N氨基酸变异位于B抗原表位, HA基因序列上共有潜在糖基化位点9 个(27、28、40、71、151、176、303、497、536), 与A/Brisbane/59/2007相同且氨基酸序列保守。本实验诊断出此次流感暴发疫情的病原体为A(H1N1)型季节性流感病毒, 研究还发现A/Yuelu/314/2009(H1N1)长沙分离株与A/Brisbane/59/2007 疫苗株基因序列比较显示并未形成一个新的变种, 推测是由于分离株与疫苗株之间基因特性的改变和人群对A(H1N1)亚型流感病毒免疫力降低导致了此次长沙麓山国际学校A(H1N1)亚型流感的暴发。     

2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

【背景】自2014年以来,H5N6禽流感病毒在我国家禽和活禽市场持续进化,成为人类和动物健康的重大威胁。【目的】对2017-2019年中国南方地区93株高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因进行分子进化分析。【方法】接种9-11日龄鸡胚分离核酸检测阳性的H5N6标本,运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,利用BLAST、MEGA6.1及Clustal X等软件进行序列分析。【结果】2017-2019年,从189份江苏省H5亚型禽类/环境标本和1名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒,完成了33株H5N6病毒的全基因组测序。下载网上同时期中国其他地区流行的H5N6毒株序列,对总计93株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析。93株H5N6病毒中有78株属于Clade 2.3.4.4h,9株病毒属于Clade 2.3.4.4e,4株H5N6病毒属于Clade 2.3.4.4b,1株属于Clade 2.3.4.4f,1株属于Clade 2.3.4.4g。所有93株病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸,表明它们都属于高致病性禽流感病毒。所有93株病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸没有发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)结合特性;158位点丧失糖基化,同时124位出现一个新的潜在糖基化位点。【结论】2017-2019年间中国南方地区H5N6病毒进化活跃,具有明显的基因多样性,需要加强对病毒分子进化的监测。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

Minor changes in the hemagglutinin of influenza A(H1N1)2009 virus alter its antigenic properties

Background

The influenza A(H1N1)2009 virus has been the dominant type of influenza A virus in Finland during the 2009–2010 and 2010–2011 epidemic seasons. We analyzed the antigenic characteristics of several influenza A(H1N1)2009 viruses isolated during the two influenza seasons by analyzing the amino acid sequences of the hemagglutinin (HA), modeling the amino acid changes in the HA structure and measuring antibody responses induced by natural infection or influenza vaccination.

Methods/Results

Based on the HA sequences of influenza A(H1N1)2009 viruses we selected 13 different strains for antigenic characterization. The analysis included the vaccine virus, A/California/07/2009 and multiple California-like isolates from 2009–2010 and 2010–2011 epidemic seasons. These viruses had two to five amino acid changes in their HA1 molecule. The mutation(s) were located in antigenic sites Sa, Ca1, Ca2 and Cb region. Analysis of the antibody levels by hemagglutination inhibition test (HI) indicated that vaccinated individuals and people who had experienced a natural influenza A(H1N1)2009 virus infection showed good immune responses against the vaccine virus and most of the wild-type viruses. However, one to two amino acid changes in the antigenic site Sa dramatically affected the ability of antibodies to recognize these viruses. In contrast, the tested viruses were indistinguishable in regard to antibody recognition by the sera from elderly individuals who had been exposed to the Spanish influenza or its descendant viruses during the early 20^th century.

Conclusions

According to our results, one to two amino acid changes (N125D and/or N156K) in the major antigenic sites of the hemagglutinin of influenza A(H1N1)2009 virus may lead to significant reduction in the ability of patient and vaccine sera to recognize A(H1N1)2009 viruses.     

应用跨膜区置换的血凝素蛋白建立H7N9禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法

【目的】由于H7N9禽流感病毒能够感染鸡,并且已经变异成了高致病性毒株,因此,鸡群中H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势,而鸡群免疫后抗体检测方法的建立也十分必要。本研究旨在建立一种灵敏、高效、高通量的鸡群H7N9亚型禽流感病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。【方法】通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达属于W1、W2-A和W2-B分支H7N9流感病毒的3种野生型血凝素(HA)蛋白,以及跨膜区(TM)置换为H3 HA TM的W2-B分支HA蛋白(H7-53TM)。4种HA蛋白经过离子交换层析纯化后作为抗原,通过ELISA检测H7N9禽流感病毒抗体。【结果】ELISA特异性、敏感性和重复性试验结果显示,跨膜区置换主要影响HA蛋白ELISA检测的重复性,以H7-53TM为抗原的ELISA方法具有较好的重复性,其批内和批间变异系数小于10%,然而3种野生型HA蛋白与部分血清反应批内和批间变异系数大于10%,重复性较差,因此选择H7-53TM蛋白作为ELISA包被抗原。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,以H7-53TM为抗原的ELISA能够精准地区分H7N9亚型流感病毒抗体阳性和阴性血清。通过相关性分析,该ELISA方法与134份鸡血清HI试验结果具有显著强相关性(r=0.854 6,P0.000 1),并且与3个分支疫苗株免疫血清的HI试验结果也具有显著相关性(r0.5,P0.05)。【结论】跨膜区置换能够提高HA蛋白抗原检测H7N9禽流感病毒抗体的重复性,并应用跨膜区置换的HA蛋白建立了一种能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。     

2010?2011年全球季节性H3N2流感病毒表面蛋白基因的分子遗传特性分析

[目的]分析2010年1月至2011年9月间全球季节性H3N2流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因的演变和分子特征,为流感病毒的防制提供分子信息依据.[方法]搜集期间季节性H3N2流感病毒HA和NA基因的完整核苷酸序列,分别绘制两基因编码序列的进化树;推导出相应的氨基酸序列,统计不同毒株间氨基酸位点差异并分析重要功能位点的变化.[结果]在136条完整的片段4和131条片段6中,2条HA和l条NA序列源自猪群流感病毒,剩余的序列根据进化特征可被分为两群.相比疫苗毒株,发生在HA和NA蛋白抗原位点的平均差异数分别为5.33和2.01个,3个毒株分别在HA宿主受体结合位点和二硫键及NA耐药位点出现突变,多数毒株的糖基化位点增多.江苏毒株和广东毒株分别属于群l和群2,且两省毒株间在HA蛋白抗原位点的差异数从7到13个不等.[结论]2010年1月至2011年9月间的全球季节性H3N2病毒主要呈现两种基因进化特征.因抗原性差异对疫苗开发具有指导作用,而多数毒株的抗原性检测信息仍然未知,但从抗原位点和糖基化位点的变异情况来看,多数毒株的抗原性可能已经变化,为判断是否形成新的流行株,应开展进一步的抗原性检测;并且各地区卫生行政部门应根据耐药位点的变化,制定相应的抗病毒治疗措施.     

Cross-neutralizing antibodies to pandemic 2009 H1N1 and recent seasonal H1N1 influenza A strains influenced by a mutation in hemagglutinin subunit 2

Pandemic 2009 H1N1 influenza A virus (2009 H1N1) differs from H1N1 strains that circulated in the past 50 years, but resembles the A/New Jersey/1976 H1N1 strain used in the 1976 swine influenza vaccine. We investigated whether sera from persons immunized with the 1976 swine influenza or recent seasonal influenza vaccines, or both, neutralize 2009 H1N1. Using retroviral pseudovirions bearing hemagglutinins on their surface (HA-pseudotypes), we found that 77% of the sera collected in 1976 after immunization with the A/New Jersey/1976 H1N1 swine influenza vaccine neutralized 2009 H1N1. Forty five percent also neutralized A/New Caledonia/20/1999 H1N1, a strain used in seasonal influenza vaccines during the 2000/01-2006/07 seasons. Among adults aged 48-64 who received the swine influenza vaccine in 1976 and recent seasonal influenza vaccines during the 2004/05-2008/09 seasons, 83% had sera that neutralized 2009 H1N1. However, 68% of age-matched subjects who received the same seasonal influenza vaccines, but did not receive the 1976 swine influenza vaccine, also had sera that neutralized 2009 H1N1. Sera from both 1976 and contemporary cohorts frequently had cross-neutralizing antibodies to 2009 H1N1 and A/New Caledonia/20/1999 that mapped to hemagglutinin subunit 2 (HA2). A conservative mutation in HA2 corresponding to a residue in the A/Solomon Islands/3/2006 and A/Brisbane/59/2007 H1N1 strains that circulated in the 2006/07 and 2007/08 influenza seasons, respectively, abrogated this neutralization. These findings highlight a cross-neutralization determinant influenced by a point mutation in HA2 and suggest that HA2 may be evolving under direct or indirect immune pressure.