安徽省七种蜜蜂病毒的发生与流行研究

【目的】调查安徽省内7种常见蜜蜂病毒:蜜蜂畸翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病病毒(Sacbrood virus,SBV)、克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)的感染发生情况,为安徽养蜂业可持续健康发展提供理论依据。【方法】运用反转录RT-PCR和序列分析比对的方法对安徽省内21个乡镇中的38个蜂场蜜蜂样品进行研究分析,以获得以上7种蜜蜂病毒的特异性发生情况。【结果】意大利蜜蜂Apis mellifera蜂场感染率:DWV(64%),IAPV(43%),CBPV(32%),ABPV(14%),BQCV(11%);中华蜜蜂Apis cerana蜂场感染率:DWV(80%),IAPV(40%),CBPV(30%),ABPV(10%),BQCV(0)。SBV和KBV在所有的蜜蜂样品中均未检测到。【结论】DWV,IAPV,CBPV,ABPV,BQCV在安徽省内大范围都存在发生流行现象,SBV和KBV对安徽蜜蜂的潜在危害可能性小。     

应用等温环介导扩增方法检测蜜蜂残翅病毒的研究

本文的目的在于建立用于临床检测残翅病病毒(Deformed wing virus,DWV)的等温环介导扩增技术(Loopmediated isothermal amplification,LAMP),为该疾病的预防和控制提供理论依据。在DWV基因保守序列设计4条引物,探究LAMP扩增的最优条件,并与常规的PCR(polymerase chain reaction)检测方法进行比较。建立的LAMP方法检测下限为0.89 pg,灵敏度比PCR高100倍而且特异性好。临床检测显示建立的LAMP方法可行、准确、方便、灵敏。针对DWV的LAMP建立的检测方法为养蜂生产第一线检测和预防DWV提供了技术支持,有一定的应用价值。     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

产肠毒素大肠杆菌快速检测方法的建立和评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的快速、便捷、敏感、特异的检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行评价,为实验动物检测和细菌性腹泻的诊断提供技术支持。方法根据GenBank公布的产肠毒素大肠杆菌的LT毒素基因序列(S60731.1)设计外引物和内引物进行LAMP扩增,对LAMP特异性和敏感性与PCR方法做比较。结果建立的LAMP方法检测最低浓度为100 pg/μL,灵敏度是PCR的10倍以上并具有较高的特异性,利用该方法对27份猴腹泻样品进行LAMP和PCR方法检测,发现PCR检出率为33.3%,LAMP(60 min内)结果与PCR相同,而LAMP(90 min内)检出率为92.6%,约是PCR检出率的3倍。结论建立了一种用于检测肠毒性大肠杆菌(ETEC)的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,适合于ETEC临床快速检测。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究

应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种准确、灵敏、快速的蜜蜂微孢子虫检测方法。本研究根据东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)序列,用在线软件Primer Explorer V4.0 online设计4条特异性引物,分别对Mg2+、d NTP、内引物FIP/BIP和甜菜碱浓度及反应温度和时间优化;选择蜜蜂体内常见病原进行该方法的特异性验证,用MseⅠ酶切扩增产物验证其准确性;将N.ceranae的DNA梯度稀释进行灵敏度检测并与PCR比较分析;最后在临床检测中验证该技术的可行性。结果表明,优化的体系可在恒温57℃下完成扩增反应;引物的病原特异性检测仅N.ceranae有梯状条带,MseⅠ酶切产物条带符合理论值;LAMP反应检测的灵敏度较PCR高10倍;能够直接从蜜蜂体内检测出N.ceranae。本研究建立的LAMP检测N.ceranae体系准确、快速、成本低,可为蜜蜂微孢子虫病的检测提供有力的技术支撑。     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。     

新疆外来入侵杂草豚草属LAMP快速检测技术的建立

【目的】开发外来入侵生物三裂叶豚草和豚草不同生育期、不同部位的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以达到田间快速、准确和高效识别的目的。【方法】以SYBR Green Ⅰ为指示剂,分别针对三裂叶豚草和豚草不同发育阶段(幼苗期、生长期、种子期)开展LAMP技术开发。【结果】特异性验证结果显示,所检测杂草的LAMP产物均呈阳性(产生白色沉淀),而与其对照的其他2种杂草的LAMP产物均为阴性(无白色沉淀)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为10^-10 ng·μL^-1,比常规聚合酶链式反应灵敏度高。【结论】本研究建立的LAMP检测体系能有效应用于三裂叶豚草和豚草样本的快速检测,为其快速、高效识别提供技术支撑。     

具有不同嗅觉学习能力的工蜂的遗传背景分析

【目的】蜜蜂是由不同亚家系组成的社会性群居昆虫,为了研究具有不同嗅觉学习能力的工蜂的遗传背景差异。【方法】本试验以中华蜜蜂Apis cerana cerana为材料,通过微卫星技术分析了两组嗅觉学习能力不同工蜂的亚家系分布情况。【结果】同一蜂群中拥有两种不同学习能力的工蜂在各亚家系的分布不存在显著差异(P>0.05)。【结论】蜜蜂嗅觉学习能力可能与亚家系组成无关,而由更精确的遗传因子调控。     

植物罹病组织中南方、爪哇、花生根结线虫的LAMP快速检测

【目的】建立一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,从植物罹病组织中直接检测3种常见的根结线虫,为根结线虫的监测和防治提供技术支持。【方法】分别采用3种根结线虫的种类特异性引物对所选择的根结线虫的DNA片段进行PCR扩增,扩增产物纯化、回收并测序。根据3种根结线虫的测序结果,针对种类特异区段,采用PrimerExplorerV4软件,分别设计3种根结线虫的LAMP引物。设计的引物组人工合成后,以提取的纯化种群线虫DNA为模板,分别进行引物组的特异性测试,筛选出分别针对3种根结线虫的最佳引物组。【结果】研究设计的3种根结线虫的LAMP特异性引物能够直接从植物根结中检测出南方、花生、爪哇3种常见根结线虫,LAMP快速检测体系为:dNTPS浓度为1 mmol·L~(-1),Mg~(2+)的浓度为5 mmol·L~(-1),不添加甜菜碱,反应时间为45 min。【结论】本实验建立的南方、花生、爪哇根结线虫LAMP快速分子检测方法,具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征,能够从罹病植物组织中快速准确地检测出南方、花生和爪哇根结线虫,具有极高的实践应用价值。     

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂 Apis cerana cerana Male abnomal 21（mab-21）基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨 Varroa destructor 前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21 cDNA,命名为 Accmab 21（GenBank登录号KR000001）。序列分析显示, 该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 kD和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂 Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。