根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的 Ti 质粒(二)

转移 DNA—T—DNAChilton 等人利用同位素标记的 Ti 质粒做探针,发现加入高浓度烟草肿瘤的 DNA 后 Ti质粒 DNA 的复性速度有加快的趋势,表明肿瘤 DNA 中有 Ti 质粒的顺序,但该顺序不多,而且没有检测到完整的 Ti 质粒。以后这些作者将章鱼肉碱型的 Ti 质粒 B6—806用内切酶Smal 分解成19个片段,分别用同位素标记做成探针,然后与肿瘤进行分子杂交,结果有二段 Ti 质粒的 DNA(3b 和10c)能和肿瘤 DNA杂交,这是二个相邻近的片段,称为 T-DNA(图4)。Ti 质粒中与肿瘤 DNA 同源的 DNA     

丹参冠瘿组织高产株系选择和丹参酮的产生

丹参(Salvia miltiorrhiza)是治疗心血管系统疾病的重要中草药。前文我们已报道了丹参冠瘿组织培养的部分研究结果^[1].利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti 质粒转化产生的冠瘿组织进行高产株系选择的研究还很少,本文报道丹参冠瘿组织高产株系选择和丹参酮产生的研究结果。     

根癌农杆菌毒力调节基因在识别寄主植物及T-DNA转移的作用

土壤病原菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过遗传转化植物细胞,引起许多植物(主要是双子叶)发生冠瘿病。转化实质在于农杆菌DNA中的一个特殊片段,T-DNA从大的(>200Kb)Ti质粒转移到植物细胞核     

农杆菌T—DNA介导的植物转基因的分子机制

前言 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与发根农根菌(A.rhizogenes)同属根瘤菌科,是革兰氏阴性植物病原菌。前者感染植物引起冠瘿病(Crop gall tumour),冠瘿病用含有抗生素的培养基培养与除菌。可无限增殖;后者感染植物诱发出许多不定根,把不定根培养在上述培养基上也可迅速生长,多次分枝成毛状称毛状根(hairy root)。农杆菌感染机理很复杂。其感染作用起始于受伤的植物细胞分泌的大量化学物质时期。受伤植物细胞分泌的酚分子诱导农杆菌怀有的Ti质粒或Ri质粒上的基因活化,尔后农杆菌紧附植物细胞并把Ti质粒或Ri质粒上一部分DNA(称作T—DNA,tranfer DNA)转移到植物染色体上。T.DNA共价整合后编译合成的新的低分量的代谢物,称为冠瘿碱。     

根癌农杆菌转化栝楼及植株再生

用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58感染栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）无菌苗诱导冠瘿瘤,获得其冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长,纸电泳检测结果表明其合成了冠瘿碱,表明Ti质粒转化成功。栝楼冠瘿组织在MS培养基上形成完整植株,移栽后良好生长。     

令人瞩目的细菌和植物的相互作用

<正> 目前,有关细菌-植物相互作用的分子生物学的大多数研究可分为两方面。1984年6月4～8日在美国康奈尔大学举行的细菌-植物相互作用的第二次学术讨论会上,这两方面都受到极大注意。会上提出的大部分论文都涉及到豆科作物(如大豆或三叶草)根系中固氮根瘤细菌功能的研究。在数量上接近第二位的是有关Ti细菌质粒的论文,该质粒在植物上引起冠瘿肿瘤,已成为重要的遗传工程工具。这些学术论文中,德国的两篇论文有些不同寻常。拜鲁兹大学的研究人员Mahavir Siagh和Walter Klingmüller研究了土壤中与小麦根系有密切关系的一种固氮微生物Enterbacter agglomerans,他们发现这种菌带有质粒,而固     

丹参的冠瘿组织培养和丹参酮的产生

用根癌农杆菌感染丹参无菌苗获得冠瘿组织,除菌后的冠瘿组织在无激素的Ms培养基上生长良好。经高压纸电泳检查,冠瘿组织中含有冠痿碱,证实根癌农杆菌的Ti质粒转化成功。冠瘿组织的生长和丹参酮的积累与基本培养基有关,B5和Ms培养基有利于生长．月增殖倍数分别达到102倍和90倍,而67-V和WP培养基则有利于丹参酮的合成,在培养过程中丹参酮能分泌到培养液中。研究表明用冠瘿组织作为培养系统,生产药用植物有效成分具有良好的开发前景。     

冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较

本文发展了一种根据NADPH消耗定量测定冠瘿组织粗酶提取液中nopaline合酶活性的方法。对于含nopaline型Ti质粒的土壤根癌杆菌菌株透发的马铃薯、向日葵、烟草和胡萝卜冠瘿系来说,出于不存在酶反应的促进剂或抑制剂,粗酶提取液中nopaline合酶的活性能够反映体内存在的此酶的酶量。用这个方法测定了四株土壤根癌杆菌菌株诱发的十六株植物冠瘿系的nopaline合酶活性,由不同菌株诱发的所有胡萝卜,烟草冠瘿素包括单细胞克隆的烟草冠瘿系,以DNA为单位的此酶量明显地低于向日葵和马铃薯冠瘿系。由此推测,不同宿主植物中nopaline合酶量的差异很大程度上取决于宿主植物本身。通过Ti质粒把外源基因导入不同植物可能有不同的命运。     

通过接种土壤杆菌将基因转移到树木中

在运用基因直接转移技术方面,近来虽然取得了相当大的进展,但目前土壤杆菌(Agro-bacterium)Ti质粒系统仍然是植物遗传工程中最有实效的方法。然而,用土壤杆菌将外来基因转移到植株中仍受这种生物体的寄主范围限制。到目前为止,还没有发现哪种松树易受土壤杆菌的感染。 R.Sederoff及其同事在为火炬松(Pinus taeda)树苗接种时,发现能使松树产生冠瘿     

植物基因载体—Ti质粒的应用方法<下>

根癌农杆菌使许多双子叶植物产生冠瘿瘤是其Ti质粒的T区DNA转入植物细胞的结果,Ti质粒是天然的植物基因载体。为克服直接操作Ti质粒的困难,人们构建了中间载体,将嵌合基因插入中间载体构成表达载体。改建的Ti质粒——pGV 3850等系统,是缺失了致瘤基因,但保持转化植物细胞的能力的Ti质粒。双质粒系统,SEV系统则是进一步完善化的Ti质粒载体。另外我们还讨论了构建其它基因载体,开辟多种转化途径的必要性。     

分离水稻根面细菌作为固氮基因质粒PRDI受体的转化研究

本文描述水稻根面细菌的积聚现象,并鉴定其常见细菌有肠细菌属(Escheriehia)、柠檬细菌属(Citrobac-ter)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia)、假单孢菌属(Pseudomonus)、黄单孢菌属(Xanebomonas)、黄杆菌属(Flavobocterium)。分离到的根面细菌对水稻幼苗有良好作用,并选到四环素敏感菌株,可以作为固氮基因质粒 PRDI 受体。用固氮基因质粒 PRDI 转化到水稻根面细菌获得一株转化体。转化体通过再转化、质粒消除试验、琼脂糖凝胶电泳、电镜观察,初步证实受体菌获得固氮基因质粒 PRDI。     

根癌农杆菌质粒:植物遗传工程可能的载体

一、冠瘿肿瘤 植物的冠瘿肿瘤是由根癌农杆菌所引起的(Smith和Townsend,1907)。许多双子叶植物,以及不少单子叶植物,在受到外损以后,经过病菌的感染,就可以诱导产生具有不能自我限制生长特性的冠瘿肿瘤。农杆菌在落地生根属(Kalanchoe)植物茎上,诱导产生冠瘿肿瘤的整个过程,不需要20小时就可以完成。     

Ti质粒T区tms基因的分离及其对高等植物分化的影响

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA带有致瘤基因,其基因1和基因2编码生长素吲哚乙酸生物合成途径中的两个酶。以pGV 354(pBR322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15—HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因1和基因2,并构建了带有卡那霉素抗性基因的重组质粒pBZ 692,通过基因载体pGV 3850,我们将基因1和基因2引入了高等植物。结果证明基因1和基因2能促使烟草、向日葵、土豆等转化组织分化长根,转化的根在MS_0培养基上能脱分化形成愈伤组织并自主生长,在转化的组织中有转化标记胭脂碱的存在。     

Ti质粒T区基因4的分离及其在高等植物中的表达

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA上带有致瘤基因,其基因4编码细胞分裂素合成酶。以pGV 354(pBR 322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15-HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因4,并通过基因载体pGV 3850引入了高等植物。结果证明基因4能促使烟草、向日葵,石刁柏等转化组织分化长芽。DNA分子杂交表明,转化的烟草中有正常植物所没有的基因4同源片段存在。     

根癌农杆菌转化桥楼及植株再生

用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58感染栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）无菌苗诱导冠瘿瘤,获得其冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长,纸电泳检测结果表明其合成了冠瘿碱,表明Ti质粒转化成功,栝楼冠瘿组织在MS培养基上形成完整植株,移栽后良好生长。     

Ti质粒T区基因转移与整合分子机制的研究进展

由根癌农杆菌Ti质粒介导的转化系统现已发展成为向许多植物转移外源基因的有效途径。然而,长期以来,人们对Ti质粒T区基因（即T-DNA）转移、特别是整合的具体细节一直不甚了解。随着对Ti质粒分子生物学及其介导转化过程研究的广泛展开与不断深入,这一天更多然的基因转移与整合过程近几年来逐步被人们所揭示和认识。     

转基因植物

转基因植物的研究始于70年代末80年代初,当时在少数植物种(如烟草、马铃薯)上由野生型 Ri 和 Ti 质粒转化的细胞再生出植株(Ackermann;Wullems 等,DeGreve 等;Spano 等;Barton 等;Ooms 等;Davrd 等;Tepfer。     

高等植物的遗传转化

自1944年Avery首次阐明肺炎双球菌的遗传转 化机理后,人们一直在探索适合高等植物的转化途径, 但早期用DNA直接处理种子或细胞均未取得成功。,。 197;年,Van LarebekeEs',等在根癌农杆菌中发现一 种与双子叶植物肿瘤诱导有关的质粒,即Ti质粒‘ 1977年ChiltonL",等用限制性内切酶谱法证明,在植 物的冠廖瘤组织中存在农杆菌Ti质粒的一个片段,称 为转移DNA (T-DNA), T-DNA在植物基因组中的 整合和表达导致肿瘤的发生。此后以Ti'质粒为基础 的植物遗传转化研究获得迅速发展,在理论和应用方 面均取得很大成就“,‘。本文主姿对植物转化的机理 和方法进行综述。     

根癌农杆菌质粒:植物遗传工程可能的载体

一、冠瘿肿瘤 植物的冠瘿肿瘤是由根癌农杆菌所引起的(Smith和Townsend,1907)。许多双子叶植物,以及不少单子叶植物,在受到外损以后,经过病菌的感染,就可以诱导产生具有不能自我限制生长特性的冠瘿肿瘤。农杆菌在落地生根属(Kalanchoe)植物茎上,诱导产生冠瘿肿瘤的整个过程,不需要20小时就可以完成。经过这个相当短的诱导时期以     

建立稳定表达人RANTES基因的夏枯草细胞克隆

为了在中药细胞中表达人源有用基因 ,以增强其特异药理活性 ,将克隆自人外周血淋巴细胞 (PBL)mRNA的RANTES基因经Ti质粒衍生的中间表达载体pROKII导入携带pAL44 0 4质粒的根癌农杆菌LBA44 0 4菌株中 ,并采用叶盘共培养法转化离体培养夏枯草细胞 ,经Southern杂交确认RANTES基因在转化细胞基因组中的整合 ,用RT -PCR扩增、Western印迹杂交和酶联免疫吸附测定 (ELISA)分析转化细胞中RANTES基因的表达 ,以PBL的过氧化物酶活性作为重组RANTES对细胞趋化性诱导的检测指标。结果表明 ,RANTES基因已在转基因夏枯草细胞中整合 ,并已形成稳定表达RANTES基因的细胞克隆 ,为进一步培育具有特异药理活性的转基因夏枯草植株打下了基础。